Ionenselektivität und Rotorkopplung des Vibrio-Flagellennatriums

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4411 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bakterien schwimmen mit einem Flagellenmotor, der von Statoreinheiten angetrieben wird. Vibrio spp. sind hochbewegliche Bakterien, die für verschiedene menschliche Krankheiten verantwortlich sind und deren polare Flagellen ausschließlich von natriumabhängigen Statoreinheiten (PomAB) angetrieben werden. Allerdings blieb weitgehend unklar, wie die Ionenselektivität erreicht wird, wie der Ionentransport die gerichtete Drehung der Statoreinheit auslöst und wie die Statoreinheit in den Flagellenrotor eingebaut wird. Hier haben wir mittels Kryo-Elektronenmikroskopie die Struktur von Vibrio PomAB bestimmt. Die elektrostatische Potentialkarte deckt Natriumbindungsstellen auf, die zusammen mit funktionellen Experimenten und Molekulardynamiksimulationen einen Mechanismus für die Ionentranslokation und -selektivität aufdecken. Sperrige hydrophobe Rückstände von PomA prägen PomA für die Drehung im Uhrzeigersinn. Wir schlagen vor, dass ein dynamisches helikales Motiv in PomA den Abstand zwischen den zytoplasmatischen Domänen der PomA-Untereinheit, die Aktivierung der Statoreinheit und die Drehmomentübertragung reguliert. Zusammen liefert unsere Studie mechanistische Erkenntnisse zum Verständnis der Ionenselektivität und des Rotoreinbaus der Statoreinheit des bakteriellen Flagellums.

Viele Bakterien rotieren Flagellen, um ihre Bewegung voranzutreiben. Das Flagellum zeichnet sich durch ein langes Filament aus, das über einen flexiblen Haken mit dem in die Zellhülle eingebetteten Rotationsmotor (oder Basalkörper) verbunden ist, der aus einem Rotor und mehreren Statoreinheiten besteht1,2,3,4. Die Flagellen-Statoreinheit nutzt die Transmembran-Ionenantriebskraft (IMF), um ein mechanisches Drehmoment zum Drehen des Flagellums zu erzeugen, das von vielen Bakterien genutzt wird, um ihre Fortbewegung in einer flüssigen Umgebung oder auf viskosen Oberflächen in eine günstige Nische zu lenken4,5,6. Angetrieben durch die Statoreinheit kann sich der bakterielle Flagellenmotor sowohl im Uhrzeigersinn (CW) als auch gegen den Uhrzeigersinn (CCW) drehen, wobei der Wechsel zwischen den beiden Richtungen durch intrazelluläre Chemotaxis-Signale gesteuert wird7,8. Die Statoreinheiten sind unbedingt für die Rotation des Flagellums und damit für die Beweglichkeit der Bakterien erforderlich, nicht jedoch für den Flagellenaufbau9,10. Darüber hinaus verbinden sich die Statoreinheiten dynamisch mit dem Rotor und lösen sich von ihm11,12,13. Durch Ändern der Anzahl der in Eingriff befindlichen Statoreinheiten kann das erforderliche Drehmoment im Verhältnis zur mechanischen Belastung abgestimmt werden14,15,16,17,18.

Jede Statoreinheit besteht aus zwei Membranproteinen, die zu einem in der Zytoplasmamembran vergrabenen Komplex zusammengesetzt sind, in dem sich ihre Transmembrandomänen als Ionenkanal organisieren19,20. Der Einbau der Statoreinheit erfordert, dass ihre zytoplasmatische Domäne mit dem Rotor interagiert und ihre periplasmatische Domäne an die Bakterienzellwand bindet21. Das durch die Ionentranslokation erzeugte Drehmoment wird über elektrostatische Wechselwirkungen an der Stator-Rotor-Schnittstelle auf den Rotor übertragen22,23,24,25. Abhängig von den leitenden Ionen können Statoreinheiten hauptsächlich in zwei Unterfamilien eingeteilt werden: die H+-getriebene Statoreinheit (z. B. MotAB) und die Na+-getriebene Statoreinheit (z. B. PomAB)26,27. Darüber hinaus wurde auch über Statoreinheiten berichtet, die Kalium und zweiwertige Ionen wie Kalzium oder Magnesium als Kopplungsionen verwenden28,29,30,31. Kürzlich wurden Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopische (Kryo-EM) Strukturen von H+-getriebenen MotAB-Statoreinheiten32,33, Kryo-EM-Strukturen intakter Flagellen-Motorkomplexe34,35,36 sowie in situ Kryo-Elektronentomographie (Kryo-EM) untersucht. ET)-Studien des Flagellenmotors21,37,38,39,40 lieferten detaillierte strukturelle und funktionale Ansichten der Statoreinheitsmontage, der Drehmomenterzeugung und der Motorfunktion1. Die Daten deuten stark auf ein Rotationsmodell für den Wirkungsmechanismus der Statoreinheiten hin. Es wird angenommen, dass sich MotA bei der Verteilung des IMF um MotB dreht, das in der Peptidoglycanschicht verankert ist. Durch den Eingriff mit dem Rotor treibt die MotA-Rotation die Drehung des großen Rotors an. Als mechanistische Grundlage für das Schalten wird ein unterschiedlicher Eingriff von MotA mit dem Rotor zwischen den Zuständen CW und CCW des Rotors vorgeschlagen.

Die Na+-betriebene Statoreinheit ist besonders wichtig für Vibrio-Arten, einschließlich pathogener Arten (z. B. V. cholerae, V. alginolyticus), da ihre polaren Flagellen nur durch den transmembranen Na+-Gradienten angetrieben werden können, und die Motilität vieler Vibrios war es auch mit ihrer Virulenz, Biofilmbildung und -verteilung verbunden41,42,43. Auf molekularer Ebene blieb jedoch unklar, wie Statoreinheiten zwischen verschiedenen Ionentypen unterscheiden und die Rotation des Flagellenmotors antreiben. Darüber hinaus ist die Na+-betriebene Statoreinheit ein ideales Thema für die Untersuchung der Ionenselektivität und der Translokationsmechanismen der Statoreinheit. Da ein Na+-Ion im Kryo-Elektronenmikroskop stärker mit Elektronen interagiert als ein Proton, könnte es möglicherweise leichter in einer hochauflösenden Kryo-EM-Karte sichtbar gemacht werden. Schließlich lassen sich Natriumionen leichter erkennen und manipulieren als Protonen44.

Eine atomare Struktur der Na+-getriebenen Statoreinheit ist daher entscheidend für die Aufklärung des Mechanismus, wie die Statoreinheit Ionen unterscheidet und den Ionentransport in ihre Rotation koppelt. Zu diesem Zweck haben wir Kryo-EM-Strukturen von Vibrio PomAB (von V. alginolyticus; als VaPomAB bezeichnet) sowohl in Detergens- als auch in Lipidumgebungen bestimmt, wobei die lokale Kartenauflösung bis zu ~2 Å erreichte. Die hochauflösende Struktur ermöglichte es uns, Na+-Ionenbindungsstellen zu lokalisieren und die strukturellen und mechanistischen Grundlagen der Ionenselektivität aufzudecken. Wir zeigen auf molekularer Ebene, wie die Statoreinheit beim Ionentransport ihre monodirektionale Rotation erreicht. Darüber hinaus haben wir ein helikales Motiv im C-terminalen Bereich von PomA (CH) identifiziert, das für die Funktion der Statoreinheit essentiell ist. Wir haben unsere Strukturergebnisse durch umfangreiche mutagenetische Analysen und Molekulardynamiksimulationen (MD) validiert. Abschließend schlagen wir vor, dass die asymmetrische zytoplasmatische Domänenanordnung der Statoreinheit eine Rolle bei der Drehmomenterzeugung und dem Montage-/Demontagemechanismus der Statoreinheit in den Rotor spielt.

Intaktes VaPomAB ist ein anisotrop geformter Komplex und zeigt eine bevorzugte Ausrichtung der Partikel im Glaseis (Abb. 1, ergänzende Abb. 2). Um die Probenhomogenität zu verbessern, haben wir das Proteinreinigungsprotokoll geändert und eine Proteasestelle im PomB-Gen nach der Plug-Region codiert, was die Entfernung der PomB-Peptidoglycan-Bindungsdomäne (PGB) während der Proteinreinigung ermöglichte (Abb. 1, ergänzende Abb. 1b). Um die bevorzugte Orientierung zu überwinden, haben wir das zwitterionische Detergens CHAPSO hinzugefügt, um die Partikelorientierung während der EM-Gittervorbereitung zu randomisieren45,46. Die Einzelpartikelanalyse ergab eine Gesamtauflösung von VaPomAB im Detergens Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG) von ~2,5 Å, wobei die Kryo-EM-Karte von ausreichender Qualität war, um ein Atommodell für den Großteil des Proteinkomplexes zu erstellen. Die lokale Auflösung, die der inneren Transmembrandomäne entspricht, nähert sich 2 Å, mit klarer Dichte für Nicht-Proteinmoleküle, was uns die Modellierung von Wassermolekülen und -ionen sowie Restseitenkettenisomeren ermöglicht (Abb. 1, ergänzende Abbildungen 2–4 und). Ergänzungstabelle 1).

eine Kryo-EM-Karte von VaPomAB. Von der Membranebene aus gesehen umgeben PomA-Untereinheiten (lila, orange, gelb, grün und rot) PomB-Untereinheiten (schwarz und weiß). Gestrichelte Linien stellen ungefähre innere Membrangrenzen dar. b Kryo-EM-Karte von VaPomAB, gesehen von der periplasmatischen Seite. c Ribbon-Modelldarstellung von VaPomAB. Untereinheiten sind wie in (a) gefärbt. d VaPomAB-Modell, gesehen von der periplasmatischen Seite. e Lokale Auflösungskarte von VaPomAB, betrachtet aus einem Querschnitt, wie in (a) angegeben. f Topologiediagramm und sekundäre Strukturelemente der Untereinheiten VaPomA (lila) und VaPomB (schwarz). Die graue Ellipse zeigt die peptidoglycanbindende Domäne (PGB) von PomB an. PP-Periplasma, IM-Innenmembran, CP-Zytoplasma, PG-Peptidoglycan, TM-Transmembran, H-Helix.

PomAB stellt die charakteristische Glockenform der Statoreinheitenfamilie zusammen, wobei die Stöchiometrie der Untereinheiten und die Gesamtarchitektur im Verhältnis 5:2 erhalten bleiben. Fünf PomA-Moleküle ordnen sich pseudosymmetrisch um zwei PomB an, wobei jede PomA-Untereinheit aus vier Transmembranhelices (TM1-TM4) besteht, die in zwei radiale Schichten gefaltet sind. Die TM3s und TM4s bilden eine innere Schicht, die die dimerisierten PomB-TMs auskleidet. Die TM1s und TM2s umgeben peripher zusammen mit PomA-Helices der periplasmatischen Schnittstelle (PI) und Helices der zytoplasmatischen Schnittstelle (CI) und bilden eine äußere Schicht, wobei eine Seite an der inneren Schicht anliegt und die andere Seite hydrophob mit der Lipiddoppelschicht interagiert. Das aufgelöste TM1 einer PomA stellt prominenten Kontakt mit dem TM2 der benachbarten Untereinheit her. Die zytoplasmatische Domäne von PomA enthält ein kompaktes Helixbündel (H1-H4), eine Region, in der durch elektrostatische Anpassung an die FliG-Drehmomenthelix des Rotors ein Drehmoment erzeugt wird. Die Kryo-EM-Karte von PomAB zeigt auch eine kurze Helix nach PomA H4, die wir als CH-Motiv (C-terminale Helix) bezeichnet haben und die an die CI-Helix einer benachbarten PomA-Untereinheit bindet (Abb. 1f). Die verstopften Motive aus zwei PomB-Ketten werden vollständig in unserer PomAB-Struktur aufgelöst, wo sie oben auf der periplasmatischen Seite der Statoreinheit positioniert sind, was mit einem verstopften autoinhibierten Zustand übereinstimmt. Wir haben auch festgestellt, dass jedes Ende des Plug-Motivs mit der PI-Helix von PomA interagiert. Wir schlagen vor, dass dies dazu führt, dass die N-terminalen Reste (Reste 1–21) von zwei PomA-Untereinheiten ungeordnet sind, da diese in unserer Kryo-EM-Karte nicht aufgelöst sind (ergänzende Abbildung 5c).

Das PomB-Plug-Motiv ist eine kurze amphipathische α-Helix, die der TM-Helix folgt. Die Löschung des Plug-Motivs führt zu einem Ioneneinstrom in das Zytosol der Zelle und führt somit bei Überexpression zu einer Hemmung des Zellwachstums48,49. Frühere Studien mittels Mutagenese- und Vernetzungsexperimenten haben kritische Reste kartiert, die an Wechselwirkungen zwischen dem PomB-Plug-Motiv und PomA48,50 beteiligt sind. In der PomAB-Struktur ist das TM von PomB über einen aus vier Resten bestehenden Linker mit der Plug-Helix verbunden (Abb. 2c), wodurch sich die Plug-Helix um ca. 145° dreht und ihr C-Terminus in Richtung der Zytoplasmamembran zeigt. Die beiden kurzen Linker stellen eine seitliche Wechselwirkung über vier Wasserstoffbrückenbindungen im Rückgrat her und organisieren die Plug-Motive als Transmode-Konfiguration relativ zu PomB TM-Helices mit einer Pseudospiegelsymmetrie senkrecht zur Zellmembran (Abb. 2a, d). Die Plug-Motive aus natrium- und protonengetriebenen Statoreinheiten weisen ein ähnliches Aminosäuremuster auf (ergänzende Abbildung 1b), bestehend aus einer hydrophoben Seite, die hauptsächlich mit der Statoreinheit selbst interagiert, und einer hydrophilen Seite, die größtenteils dem Periplasma ausgesetzt ist Weltraumlösungsmittel (Abb. 2b). Die Kontaktumgebung des PomB-Plug-Motivs wird hauptsächlich durch einen Spalt verursacht, der von der periplasmatischen Seite von TM4, TM3 und der PI-Helix einer PomA-Untereinheit und der periplasmatischen Seite von TM3 und TM4 der benachbarten PomA-Untereinheit eingerahmt wird. Drei Reste des Plug-Motivs (I50, M54 und F58) dringen tief in diesen Spalt ein und bewirken hydrophobe Wechselwirkungen (Abb. 2e, f). Darüber hinaus ist der aromatische PomB F47-Ring über CH-π-Wechselwirkungen zwischen dem Pyrrolidinring von P172 und der Seitenkette von M169 von PomA eingebettet, wodurch das Plug-Motiv weiter stabilisiert wird (Abb. 2f). Die 5:2-Stöchiometrie der Statoreinheit erzeugt unäquivalente Bindungsumgebungen für die beiden Plug-Motive, wie durch Berechnung der vergrabenen Oberfläche der Oberfläche und der freien Energien der Reste, die die Plug-Helix bilden (Reste 44–58, Abb. 2g, h), untersucht wurde. Daher spekulieren wir, dass das Lösen des Steckermotivs von der Statoreinheit während der Aktivierung der Statoreinheit kein symmetrischer Prozess ist. Stattdessen löst sich wahrscheinlich zuerst ein Plug-Motiv mit relativ geringer Bindungsenergie von seiner Hemmstelle, und dann wird die Freisetzung des zweiten Plug-Motivs induziert. PomB G59 markiert das Ende des Plug-Motivs und übt einen direkten Einfluss auf die Konformation der PomA-PI-Helix aus. Wir fanden heraus, dass jedes der PomB-Plug-Motive zwei unterschiedliche Konformationen der PomA-PI-Helix induziert, die PomA TM1 und TM2 verbindet; Eine Konformation ähnelt der in den anderen drei PomA-Untereinheiten beobachteten Konformation, und die andere Konformation erweitert TM2 um eine weitere helikale Windung, an der Reste von L26 bis V32 beteiligt sind (ergänzende Abbildung 5c).

ein VaPomAB in seinem autoinhibierten Zustand, von der Ebene der Membran aus gesehen, wobei PomB als Bänder (schwarz und weiß) und PomA als halbtransparente Oberflächendarstellung dargestellt sind. Die Aspartatreste D24 von beiden PomB TM sind angegeben und als Stäbchen dargestellt. b Draufsicht auf VaPomAB mit PomB als Bänder und PomA als entsprechend seiner Hydrophobie gefärbte Oberflächendarstellung. c Draufsicht auf VaPomAB. PomA-Untereinheiten werden als Oberflächendarstellung und PomB-Untereinheiten als Bänder dargestellt, gefärbt wie in Abb. 1a. d Nahaufnahme von der periplasmatischen Seite der Wechselwirkungen der Linker (Phe39-Asp43), die PomB-Plug-Motive und TMs verbinden (entspricht dem gelben Kasten in (c)). Wasserstoffbrückenbindungen sind als gestrichelte Linien dargestellt. e Plug-Motiv aus der PomB(2)-Bindungsumgebung (Black Box in (c)). f Plug-Motiv aus der PomB(1)-Bindungsumgebung (rotes Kästchen in (c)). g, h Berechnete vergrabene Grenzflächenfläche und freie Energie von PomB-Plug-Motiven.

Die Dynamik der PomA-PI-Helices, die aus der PomB-Plug-Motiv-Wechselwirkung resultiert, bestimmt vermutlich die Flexibilität des entsprechenden TM1, da letzteres in zwei der PomA-Untereinheiten nicht aufgelöst werden konnte. Die hochauflösende PomAB-Struktur wurde in einer Detergensmizellenumgebung bestimmt, was die Möglichkeit erhöht, dass Detergensmoleküle einen Einfluss auf die Konformation von PomAB haben könnten, insbesondere auf die membranseitigen Helices, einschließlich des ungeordneten TM1 aus zwei PomA-Untereinheiten. Um dies zu klären und die natürliche Umgebung der Statoreinheit besser nachzuahmen, haben wir VaPomAB in Nanodiscs des Membrangerüstproteins 1D1 (MSP1D1) sowie ungespaltenes VaPomAB voller Länge in Saposin-Nanodiscs mit polaren Lipiden aus E. coli rekonstituiert bestimmte die Kartenauflösung bei 3,9 Å bzw. 6,3 Å (Ergänzende Abbildungen 3 und 4). In beiden Fällen konnten wir alle Sekundärstrukturelemente des PomAB-Komplexes mit Ausnahme der beiden PomA-TM1-Helices aufspüren (ergänzende Abbildungen 5f, 5i). Der Vergleich der PomAB-LMNG-Struktur mit der Lipid-rekonstituierten MSP1D1-Struktur ergab keine größeren Konformationsunterschiede (quadratische Abweichung von 0,642 Å, 1.312 ausgerichtete Cα-Atome), die auf Detergensartefakte zurückzuführen sein könnten. Dies weist darauf hin, dass die Flexibilität dieser beiden TM1-Helices in der inaktiven Statoreinheit wahrscheinlich intrinsisch ist, was bei der Aktivierung der Statoreinheit funktionell wichtig sein könnte.

Statoreinheiten verwenden bestimmte Ionen, um die Rotation des Flagellenmotors anzutreiben. Jedes MotB/PomB TM enthält ein Aspartat (D24 in PomB), das für die Bindung und Translokation ankommender Ionen aus dem periplasmatischen Raum zur zytoplasmatischen Seite verantwortlich ist (Abb. 2a). Dieses Aspartat ist jedoch in den Familien der Statoreinheiten allgemein konserviert (ergänzende Abbildung 1b), wodurch die strukturelle und mechanistische Grundlage der Ionenselektivität unklar wird. Die PomAB-Struktur zeigt, dass sich die D24 zweier PomB-Ketten in unterschiedlichen Umgebungen befinden; D24 der Pom-B-Kette 1 interagiert mit PomA, was wir als engagierten Zustand bezeichnen; während D24 der PomB-Kette 2 in Richtung der zytoplasmatischen Domäne zeigt und die Wechselwirkung mit PomA unterbricht, was wir als gelösten Zustand bezeichnen (Abb. 3a). Die Untersuchung der hochauflösenden Dichtekarte in der Umgebung dieser beiden Aspartate zeigt Nichtrückstandsdichten. An Stelle 1, in der Nähe des beteiligten PomB D24 (PomB-Kette1), wird die zusätzliche Dichte durch Sauerstoffatome aus den Hydroxylgruppen der Seitenketten von PomB T21 und D24 und den Rückgrat-Carbonylgruppen der benachbarten PomA P151 und PomB G20 koordiniert. Eine fünfte koordinierende Wechselwirkung entsteht durch eine Wasserstoffbindung eines Wassermoleküls in der Nähe von PomA A190, und der durchschnittliche Abstand zwischen dem Dichtezentrum und den damit verbundenen Sauerstoffatomen beträgt 2,88 Å (Abb. 3b). An Stelle 2, in der Nähe des gelösten PomB D24, das flexibler ist, was durch die leicht verschwommene EM-Dichte seiner sauren Seitenkette angezeigt wird, ist eine kugelförmige Dichte durch Sauerstoffatome, die ausschließlich von PomA TM3 und TM4 beigesteuert werden, gut koordiniert: Hydroxylgruppen der Seitenkette von T158, T185 und T186 sowie exponierte Rückgrat-Carbonylgruppen von G154 und A182 mit einem durchschnittlichen Abstand zwischen dem Dichtezentrum und dem zugehörigen Sauerstoff von 2,33 Å (Abb. 3c). Angesichts der günstigen lokalen chemischen Umgebung des Kations an diesen beiden Stellen und insbesondere der typischen Geometrie der Na+-Koordination51 an Stelle 2 haben wir diese Dichten als Na+-Ionen modelliert, die die vorherrschenden Kationen im Proteinreinigungspuffer waren. Um das Modell weiter zu validieren, führten wir zwei explizite Lösungsmittel-Allatom-MD-Simulationen durch (jeweils 1 µs) und beobachteten, dass das Na+-Ion an Stelle 1 sehr stabil war, das andere Na+-Ion an Stelle 2 sich jedoch schnell zu einer gebildeten Zwischenstelle bewegte durch die Seitenkette von D24, T158 und T186 und anschließend an eine Stelle, die symmetrisch zu Stelle 1 ist, und schließlich in den zytoplasmatischen Raum freigesetzt (ergänzende Abbildung 6c – d und ergänzender Film 1). Wir beobachteten auch eine signifikante Konformationsdynamik einiger polarer Reste um Stelle 2, insbesondere T158, T186 in PomA-Kette 5 und D24 in PomB-Kette 2 (Ergänzende Abbildungen 6a und 7). Im Gegensatz dazu waren T186 in der PomA-Kette 2 und D24 in der PomB-Kette 1 an der betroffenen Stelle jedoch viel stabiler (Ergänzende Abbildungen 6a – b und 7d).

a Querschnittsansicht (entsprechend der Ansicht im linken Feld und um 90° gedreht) von Na+-Ionenbindungsstellen (cyanfarbene Kugeln) in der Nähe der beiden Asp24 von PomB. b Details der Na+-Ionenbindungsstelle in der Nähe von PomB(1), an der Asp24 beteiligt ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit überlappen sich die entsprechenden EM-Dichten nur im Bereich von PomB(1) Gly20-Asp24, Na+-Ion und Wassermolekül. Wasserstoffbrückenbindungen sind als gestrichelte Linien mit Abständen in Angström dargestellt. c Details der Na+-Ionenbindungsstelle in der Nähe des gelösten PomB(2) Asp24. Die EM-Dichte wird dem Na+-Ion überlagert. d Na+-Ionen-Translokationsweg (gestrichelte Linie mit Pfeil). Periplasmatische und zytoplasmatische Kanäle sind angezeigt, deren Oberfläche durch elektrostatisches Potential gefärbt ist (positiv geladen, blau; negativ geladen, rot). Cα-Atome der Reste, die das mutmaßliche hydrophobe Tor bilden, der Glycine, die das Glycin-Zipper-Motiv bilden, und der PomB (2) S27- und D24-Cα sind angedeutet und als Kugeln dargestellt. e, Draufsicht auf den Na+-Ionentranslokationsweg. f VaPomAB-Natriumionen-Bindungsumgebung in der Nähe der betroffenen Stelle. Die Oberfläche von PomA ist durch Hydrophobie gefärbt. g Ähnliche Ansicht wie in (f), jedoch in der protonengetriebenen Statoreinheit CjMotAB. h Ähnliche Ansicht wie in (f), jedoch in der protonengetriebenen Statoreinheit BsMotAB. i Vergleich der Motilitätsfähigkeit der VaPotAB-Konstrukte und Punktmutanten der Reste in der Nähe der Na+-Ionenbindungsstelle oder der Reste entlang des Na+-Translokationswegs. „∆MotAB VC“ steht für einen leeren Vektor, der in einen mutierten Salmonella enterica-Stamm umgewandelt wurde, dem sein Wildtyp-MotAB fehlt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Identifizierung der Na+-Bindungsstellen anhand der EM-Dichte und der asymmetrischen Konformationsdynamik veranlasste uns zu der Vermutung, dass zumindest ein Teil des PomAB-Ionenselektivitätsfilters innerhalb der PomA-Untereinheit und dieser drei Threoninreste (PomA T158, T185 und T186) liegt. die in allen natriumbetriebenen Statoreinheiten erhalten bleiben (ergänzende Abbildung 1a), sind für die Selektivität und den Transport von Na+-Ionen verantwortlich. Bemerkenswert ist, dass das T158 der PomA-Kette 2, in der Nähe des beteiligten PomB D24, nicht direkt zur Na+-Bindung beiträgt. Stattdessen richtet es seine Seitenkette so aus, dass eine Wasserstoffbindung mit PomB D24 entsteht (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass während des Na+-Ionentransports eine lokale Konformationsänderung auftritt. In ähnlicher Weise beobachteten wir an derselben Stelle der anderen drei PomA-Untereinheiten keine Dichten, die einem Na + -Ion entsprachen (ergänzende Abbildung 8a – f), was darauf hindeutet, dass während jedes Rotationsschritts der Statoreinheit nur ein Na + -Ion zugeführt würde.

Um die funktionelle Rolle von Schlüsselresten für die Ionenselektivität der Na+-gesteuerten Statoreinheit zu untersuchen, haben wir zunächst ein chimäres PomAB (umbenannt in VaPotAB) entworfen, indem wir PomB PGB durch S. enterica MotB PGB ersetzt haben, eine Strategie, die der in früheren Studien verwendeten ähnelt52 ,53. Ein für VaPotAB kodierendes Plasmid verlieh Weichagarplatten einen beweglichen Phänotyp, wenn es in einen mutierten Salmonella enterica-Stamm transformiert wurde, dem sein Wildtyp-MotAB fehlt (Abb. 3i). Anschließend generierten wir Punktmutationen in VaPotAB, um die Bedeutung der drei Schlüssel-Threonine für die Flagellenmotorrotation durch Untersuchung des Motilitätsphänotyps zu bewerten. Wir fanden heraus, dass der Ersatz eines dieser drei Threonine durch Alanine die bakterielle Motilität aufhebt, was die Bedeutung dieser Reste für die Funktion der Statoreinheit bestätigt (Abb. 3i). Der Na+-Ionenbindungshohlraum scheint daher eine strikte Voraussetzung für die Ionenselektivität zu sein. Wir stellen fest, dass ein K+-Ion, das einen größeren Radius als das Na+-Ion hat (1,52 Å gegenüber 1,16 Å) und einen durchschnittlichen Bindungsabstand von etwa 2,7–3,2 Å aufweist, in diesem Hohlraum nicht untergebracht werden kann. Um die Na+-Selektivität in diesem Hohlraum zu quantifizieren, führten wir Berechnungen zur Störung der freien Energie durch und stellten fest, dass Na+ eine um 4,37 ± 0,7 kJ/mol niedrigere freie Bindungsenergie als K+ aufweist, was darauf hindeutet, dass dieser Hohlraum Na+ gegenüber K+ bevorzugt. Andererseits ist H+ zu klein, um diesen Hohlraum zu füllen, und es ist energetisch ungünstig, ein H3O+ mit einer Koordinationszahl von fünf zu binden. Daher können K+ und H+ (oder H3O+) von PomAB nicht als Kopplungsionen verwendet werden. Zweiwertige Ionen wie Ca2+ und Mg2+, für deren Neutralisierung und Koordination weitere negativ geladene Reste erforderlich wären, werden in diesem Hohlraum wahrscheinlich ebenfalls nicht bevorzugt.

Darüber hinaus haben wir die PomAB-Struktur mit den verfügbaren H+-getriebenen Statoreinheitsstrukturen, C. jejuni MotAB und B. subtilis MotAB, verglichen, um den Grund zu untersuchen, warum H+-getriebene Statoreinheiten Natrium oder andere Alkalimetalle nicht als Kopplungsionen verwenden können. In dem Teil der Struktur der H+-getriebenen Statoreinheit, der der entsprechenden Na+-Bindungsstelle 2 in PomAB entspricht, sind zwei Threonine (T158 und T185) durch Alanin ersetzt, wodurch in diesem Hohlraum Sauerstoff fehlt, was wahrscheinlich die Bindung von Alkalimetallionen verhindert (Ergänzende Abbildungen 1a und 8g – i). An der äquivalenten Position des PomB-gebundenen D24, nahe dem Wassermolekül, das die Na+-Bindungsstelle 1 koordiniert, enthält die H+-getriebene Statoreinheit einen Isoleucinrest anstelle eines Alanins oder eines polaren Rests, was diese Region hydrophob macht und nicht begünstigt eine Alkalimetallionenkoordination (Abb. 3f – h). Daher fehlt an beiden Stellen in der H+-getriebenen Statoreinheit die Kontaktumgebung für Alkalimetallionen, was die Annahme stützt, dass die Restvariabilität in PomA/MotA einen großen Einfluss auf die Ionenselektivität hat.

Die Analyse der Strukturassemblierungsschnittstelle zwischen PomA- und PomB-Untereinheiten auf periplasmatischer Ebene zeigt, dass diese innere Kontaktschnittstelle hauptsächlich von hydrophoben Resten ausgekleidet ist (Abb. 4a), wobei die Dicke etwa vier helikale Windungen (von PomB S27 bis S38) umfasst. Es ist daher unwahrscheinlich, dass in dieser Region ein wässriger Kanal gebildet wird, der den Na+-Ionenfluss durch PomAB vermittelt. Vielmehr könnte ein potenzieller Na+-Translokationsweg basierend auf der PomAB-Struktur und unserem funktionellen Motilitätstest abgegrenzt werden. Es erstreckt sich von der Na+-Bindungsstelle 2 bis zum periplasmatischen Raum und wird auf der einen Seite durch die PI-Helix und den Anfang der TM2-Helix derselben PomA-Untereinheit und auf der anderen Seite durch das Ende von TM1 der benachbarten PomA-Untereinheit abgegrenzt (Abb. 3d, e). Der Ionentranslokationsweg in diesem Teil enthält ein hydrophobes Tor (Abb. 3d), das wahrscheinlich die Hydratationshülle des einströmenden Na+ entfernt; und in Richtung des periplasmatischen Raums ist der Translokationsweg von mehreren polaren Resten wie D31, T33 und S34 gesäumt, von denen viele konserviert sind (ergänzende Abbildung 9b – c). Der Na+-Translokationsweg reicht bis zum PomB D24 und zum inneren Lumen der zytoplasmatischen Domäne von PomA, wo das elektrostatische Oberflächenpotential sehr negativ ist (Abb. 4d) und zusammen mit dem N-Terminus von PomB, der mehrere negativ geladene Reste enthält (ergänzende Abb . 1b), könnte das einströmende Na+ anziehen. Wir fanden auch heraus, dass PomA TM3 ein streng konserviertes GXXGXXXG-Motiv (Reste G154-G161) enthält, eine typische „Glycin-Reißverschluss“-Struktur, die zur Kanalbildung in vielen Membranproteinen beiträgt54. Glycine aus dem „Glycin-Reißverschluss“-Motiv stehen der TM3- und TM4-Assemblierungsschnittstelle gegenüber, halten den Na+-Selektivitätsfilter in einer mittleren Position und tragen zusammen mit dem konservierten P151 zur Konformationselastizität der Hauptkette dieser Region bei, wenn ein Na+-Ion durch TM3 und passiert TM4-Spalte. Durch den Ersatz des Glycinrests durch Leucin im „Glycin-Reißverschluss“ wird die Bakterienmotilität aufgehoben (Abb. 3d, ergänzende Abb. 1a und 14a).

eine VaPomAB-Assemblierungsschnittstelle auf der Ebene des periplasmatischen Raums und der Transmembrandomäne, wobei die Oberfläche je nach Hydrophobie gefärbt ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden die beiden vorderen Ketten gelöscht und die PomB-Ketten als Band dargestellt. b Konformationsisomere von M155 in der Nähe von PomB aktivierten D24 und deaktivierten D24. EM-Dichten sind der Seitenkette von M155 überlagert. c Vergleich der Motilitätsfähigkeit der VaPotAB-Konstrukte und Punktmutanten des Rests M155 sowie Reste von PomB in der Nähe von M155. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d Konformationsisomere von M155, gesehen von der Oberseite der Membran. Der ausgefüllte Kreis gibt die Rotationsrichtung von PomA um PomB an. Ein möglicher Konflikt, der auftreten würde, wenn PomA sich gegen den Uhrzeigersinn um PomB drehen würde, wird durch ein rotes Siebeneck angezeigt.

Anhand unserer expliziten Lösungsmittel-MD-Simulationen haben wir auch beobachtet, dass die Seitenkette von T33 auf der periplasmatischen Seite konformativ dynamisch war und von Wassermolekülen umgeben war, die gelegentlich in den Raum neben der Seitenkette von T185 diffundieren konnten (ergänzende Abbildung 7c und). Daher schlagen wir vor, dass die durch T33 und einige andere polare Reste gebildete Hydratationstasche die Eintrittsstelle des vorgeschlagenen Na+-Translokationswegs ist. Beachten Sie, dass wir keinen kontinuierlichen Hydratations- oder Na+-Translokationsweg zur Verbindung der periplasmatischen Seite und der Na+-Stelle 2 beobachtet haben, wahrscheinlich weil sich diese Struktur im selbsthemmenden verstopften Zustand befand und die Simulationszeit (1 µs) auch viel kürzer war als die Zeitskala der Kanalöffnung.

Nachdem wir den Ionenselektivitätsmechanismus der Statoreinheitsfamilie im Kontext der hochauflösenden Karte von PomAB analysiert hatten, versuchten wir als nächstes, die strukturellen Grundlagen der Rotationsrichtung der Statoreinheit zu verstehen. Kryo-ET-Studien an Basalkörpern von V. alginolyticus und Borrelia burgdorferi zeigen, dass bei Drehung des Rotors im Uhrzeigersinn seine C-Ring-Komponente FliG mit der proximalen Seite der zytoplasmatischen Domäne der Statoreinheit (der Seite, die der Motorachse zugewandt ist) interagiert. Wenn der Rotor verriegelt ist und sich im Uhrzeigersinn dreht, interagiert FliG hingegen mit der distalen Seite der zytoplasmatischen Domäne der Statoreinheit. Die Umschaltung der Rotorrichtung von der CCW- auf die CW-Rotation erfordert eine Umgestaltung und Erweiterung des C-Rings durch Änderung seiner Konformation beim Empfang eines intrazellulären Chemotaxissignals 38, 39. Somit kann die Statoreinheit sowohl die CW- als auch die CCW-Rotation des Flagellenmotors mit einer relativ festen Position antreiben, indem sie sich über das PGB-Motiv an der Peptidoglycanschicht verankert.

Von der Ebene der inneren Membran aus gesehen beobachten wir, dass die sperrige hydrophobe Seitenkette von M155 aus der PomA-Kette 2 horizontal zum involvierten PomB D24 ausgerichtet ist (Abb. 4b), was zeigt, dass M155 die Rotation von PomA zur CCW um PomB bei sterisch behindert die betroffene D24-Stelle (Abb. 4d). Währenddessen hebt M155 aus der PomA-Kette 4 seine Seitenkette an, um über das gelöste D24 zu schreiten, bei dem die Wechselwirkung mit PomA nahezu fehlt, wodurch D24 den erforderlichen Raum bietet, um das Na+-Ion aus dem Selektivitätshohlraum zu sammeln (Abb. 4b, d). . Wir stellten die Hypothese auf, dass die sperrige Seitenkette der PomA-Position 155 der „Verstärkungspunkt“ für die Richtungsrotation der Statoreinheit ist. Um diese Hypothese zu testen und die Bedeutung der sperrigen Seitenkette an dieser Position zu verifizieren, haben wir zunächst diesen Methioninrest durch Alanin ersetzt. Die M155A-Mutation zerstörte die bakterielle Beweglichkeit. Im Gegensatz dazu behielt der Ersatz von Methionin durch Leucin, einem Rest in der äquivalenten Position, der häufig in H+-gesteuerten Statoreinheiten vorkommt, die Motilität von 80 % bei. Eine Vergrößerung der Rückstände in der Nähe von PomA M155 von PomB (PomB F22Y und L25F) beeinträchtigte die Motilität (Abb. 4c). Daher bestätigen unsere Strukturanalyse und Funktionsdaten, dass ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette in der Nähe der Ionenkopplungsstelle (D24 in PomB) erforderlich ist, um die korrekte Drehrichtung der Statoreinheit zu ermöglichen. Sein Konformationsisomer (ergänzende Abbildung 10), das wahrscheinlich durch die lokale strukturelle Neuordnung während der Aktivierung der Statoreinheit induziert wird, ist notwendig, um in diesem Bereich Flexibilität für den Ionentransport zu erreichen. Dieser sperrige hydrophobe Rest ist nicht nur in Flagellenstatoreinheiten, sondern auch in anderen 5:2-Rotationsmotoren konserviert, was auf einen ähnlichen Mechanismus zur „Verstärkung“ der Richtungsrotation schließen lässt (ergänzende Abbildung 11). Die Statoreinheit ist somit ein voreingestellter CW-Rotationsmotor, der durch die Transmode-Konformation des PomB-Plug-Motivs auf der periplasmatischen Seite fest blockiert wird, bevor er in den Rotor integriert wird. Aufgrund der strukturellen Zusammenstöße (Abb. 4d) und des negativen elektrostatischen Potenzials des zytoplasmatischen Innenlumens von PomA wird die Geometrie der Statoreinheit kein Modell begünstigen, bei dem sich PomA gegen den Uhrzeigersinn um PomB dreht, wenn die Ionenantriebskraft umgekehrt wird. Dies steht im Einklang mit frühen Experimenten, die zeigten, dass die Statoreinheit inaktiviert wird, wenn der IMF abgebaut oder umgekehrt wird56, und dass eine erhöhte Natriumkonzentration im Zytoplasma die Rotation von PomAB49 hemmt.

Die zytoplasmatische Domäne der Statoreinheit spielt eine entscheidende Rolle beim Rotoreinbau, der Drehmomenterzeugung und der Demontage vom Rotor1,44. Die zytoplasmatische Domäne jeder PomA-Untereinheit enthält vier kurze Helices, die nahezu vertikal zur Innenmembran verlaufen. Sie umgeben den intrazellulären Teil der PomA-TM3- und TM4-Helices peripher und bilden zusammen ein kompaktes Helixbündel, das etwa 35 Å in das Zytosol hineinragt (Abb. 5a – c). Die zytoplasmatischen Domänen von fünf PomA-Untereinheiten divergieren in Richtung ihres intrazellulären Endes, wobei die lokale Auflösung dieser Region im Vergleich zur TMD erheblich abnimmt. Dies steht im Einklang mit der Modell-B-Faktor-Verteilung, bei der die zytoplasmatische Domäne von PomAB einen höheren B-Faktor-Wert aufweist (ergänzende Abbildung 12), was die Flexibilität dieser Region widerspiegelt. Die rotierende Statoreinheit erzeugt ein Drehmoment, indem sie die komplementär geladenen Reste mit der FliG-Drehmomenthelix des Rotors in Einklang bringt. Es wird vorhergesagt, dass dieser drehmomenterzeugende Modus bei allen Bakterienarten erhalten bleibt22,24,57. Wir definieren die FliG-Drehmomenthelix-Bindungsschnittstelle von der Statoreinheit wie folgt: Positiv geladene Reste einer PomA-Untereinheit tragen zur Hauptfläche oder (+)-Fläche bei, und negativ geladene Reste der benachbarten PomA-Untereinheit tragen hauptsächlich zur komplementären Fläche oder bei (−) Gesicht (Abb. 5b, c). Die PomAB-Struktur ermöglicht es uns, die Positionen der Schlüsselreste abzubilden, die an der Stator-Rotor-Wechselwirkung beteiligt sind. Wir fanden drei positiv geladene Reste von H1 und H4 auf der (+)-Fläche, R88, K89 und R232, und zwei negativ geladene Reste von H2 und H3 auf der (-)-Fläche, D114 und E96, wenn die Ladung unterdrückt wird oder umgekehrt, die Motilität stark beeinträchtigen (Abb. 5h). Wichtig ist, dass die Ladung von R88 auf der (+)-Seite und D114 und E96 auf der (−)-Seite, deren Seitenketten in Richtung der PomA-Verbindung zwischen den Untereinheiten ragen, für die Beweglichkeit unverzichtbar sind, was bestätigt, dass sowohl die (+)- als auch die (−)-Seite von PomA sind notwendig und direkt an den Wechselwirkungen mit der FliG-Drehmomenthelix beteiligt. Darüber hinaus bildet R232 eine Salzbrücke zwischen den Domänen mit dem Rest D85, die wahrscheinlich nicht nur die Helixbündelorganisation stabilisiert, sondern auch zur FliG-Drehmomenthelixbindung beiträgt. Die R232A-Mutation beeinträchtigt die Motilität und die D85A-Mutation führt zu einem Funktionsgewinn-Phänotyp (Abb. 5b).

ein elektrostatisches Potential der zytoplasmatischen Domäne von PomAB. b Positionen der Schlüsselreste, die für die Bindung der FliG-Drehmomenthelix verantwortlich sind, wobei die positiv geladenen Reste der Hauptschnittstelle hervorgehoben werden. c, ähnlich wie b, aber mit Hervorhebung der negativ geladenen Reste der komplementären Grenzfläche. d Die C-terminale Domäne von VaFliG (basierend auf Homologiemodellierung), die die drehmomenterzeugende Helix enthält, ist dargestellt und ihre Länge ist angegeben. e Wechselwirkungen zwischen PomA CH-Helix und CI-Helix. Eine Site ohne Interaktion wird hervorgehoben und mit einer durchgezogenen Linie umkreist. f Bild von einem Blick aus der zytoplasmatischen Domäne. Angegeben sind die Abstände zwischen dem Massenschwerpunkt der Reste K89, R88 und dem Massenschwerpunkt der Reste D114, E96 benachbarter PomA-Untereinheiten. g Detaillierte Wechselwirkungen zwischen CH-Motiv und CI-Helix. An Wechselwirkungen beteiligte Reste werden als Stäbchen dargestellt. h Vergleich der Motilitätsfähigkeit der VaPotAB-Konstrukte und Punktmutanten der Reste, die an der FliG-Torque-Helix-Interaktion oder der C-terminalen Verkürzung von PomA beteiligt sind. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unerwarteterweise fanden wir direkt nach der H4-Helix im C-terminalen Teil von PomA ein helikales (CH) Motiv. Das CH-Motiv verläuft parallel zur Membranebene und bindet an die CI-Helix einer benachbarten PomA-Untereinheit. In vier PomA-Untereinheiten konnten wir die gesamten CH-Motive vom Rest K246 bis zu seinem C-terminalen Ende D253 verfolgen, wobei der Kontakt zwischen CH und CI hauptsächlich durch elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen vermittelt wurde (Abb. 5g). Das verbleibende CH-Motiv ist ungeordnet, ohne dass eine bestimmte Dichte beobachtet wird (Abb. 5e). Dieses ungeordnete CH-Motiv ist wahrscheinlich auf die Asymmetrie der PomAB-Anordnung zurückzuführen, bei der es zwei PomA-Untereinheiten auf einer Seite der PomB-Plug-Motive und drei auf der anderen Seite gibt und für dieses CH-Motiv weniger Platz zur Interaktion mit der benachbarten PomA-CI-Helix vorhanden ist . Die Ablösung von CH von CI an einer Stelle zwischen den Untereinheiten führt dazu, dass die zytoplasmatischen Domänen von PomA ein unregelmäßiges Fünfeck bilden, wie durch die Messung der Abstände der Ladungsreste gezeigt wird, die für die Bindung der FliG-Drehmomenthelix verantwortlich sind (der Massenschwerpunkt von K89 und R88 zum Zentrum von). Masse von D114 und E96) (Abb. 5f). Die C-terminale Region von PomA ist in Länge und Sequenz unter den Subtypen der Statoreinheiten weniger konserviert (ergänzende Abbildung 1b). Wir führten eine Verkürzung des C-terminalen Endes von PomA durch und stellten fest, dass die Verkürzung des PomA CH-Motivs die Motilität vollständig aufhob (Abb. 5h). Basierend auf diesen Erkenntnissen und unserer Strukturanalyse bestätigen wir, dass das PomA-CH-Motiv und die CH-CI-Wechselwirkung für die Aufrechterhaltung der Statoreinheitsfunktion von entscheidender Bedeutung sind.

Seit bei Vibrio-Arten erstmals festgestellt wurde, dass ihre polaren Flagellenmotoren durch eine Natriumantriebskraft angetrieben werden19,58, wird die Na+-angetriebene Statoreinheit seit Jahrzehnten intensiven funktionellen und strukturellen Untersuchungen unterzogen59. Während die Statoreinheit von V. alginolyticus (VaPomAB) als Prototyp für die Superfamilie der Na+-getriebenen Statoreinheiten diente, hat sie sich bisher als ungeeignet für die Strukturanalyse erwiesen. Um diese Wissenslücke zu schließen, haben wir hier eine hochauflösende Struktur der Na+-angetriebenen Statoreinheit ermittelt.

Die Trans-Konformation der Plug-Motive scheint ein universelles Merkmal der Familie der Statoreinheiten zu sein, und ihre strukturelle Konfiguration erklärt, wie ihre Organisation die Rotation der Statoreinheit stark einschränkt (ergänzende Abbildung 13). Die Plug-Motive verhindern auch den Ioneneinstrom in die zytoplasmatische Domäne, bevor die Statoreinheit in den Rotor integriert wird. Ihre unterschiedlichen Interaktionsumgebungen, die durch die unausgeglichene Stöchiometrie der PomA5:PomB2-Untereinheit verursacht werden, lassen auch auf ihre asymmetrische Freisetzung während der Stator-Rotor-Wechselwirkung schließen. Das Signal, das die Freisetzung des periplasmatischen Plug-Motivs fördert, wird wahrscheinlich durch die Wechselwirkung zwischen zytoplasmatischer Statoreinheit und Rotor beim Einbau der Statoreinheiten in den Motor ausgelöst, wobei der Signalübertragungsweg wahrscheinlich über periphere PomA-Transmembranhelices verläuft, insbesondere über die beiden dynamischen PomA TM1 Helices. Die Freisetzung des Plug-Motivs könnte dann die Dimerisierung von PomB-PGB-Motiven erleichtern, die durch Erkennung der Peptidoglycan-Komponenten durch den dimerisierten PGB-Grenzflächenbereich die Zellwand erreichen und dort verankern können. Dadurch entsteht eine räumliche Spannung, die eine erneute Bindung des freigesetzten Plug-Motivs an das aktivierte verhindert Statoreinheit. Daher repräsentieren nur die im Rotor integrierten, nicht angeschlossenen Statoreinheiten ihren vollständig aktivierten Zustand. Tatsächlich konnten wir das nicht angeschlossene PomAB nicht reinigen, nachdem wir das PomB-Plug-Motiv gelöscht hatten. Wahrscheinlich baute sich der Plug-Deletion-PomAB-Komplex nicht gut zusammen und war aufgrund von Ionenaustritt toxisch für die Zellen, und der nicht-plugged-PomAB-Komplex ist beim Einbau in den Rotor stabiler.

Der in der PomAB-Struktur identifizierte Ionenpermeationsweg bietet einen Energievorteil, indem er den Natriumionen-Translokationsweg von der periplasmatischen Seite zum wichtigsten ionenakzeptierenden Rest PomB D24 verkürzt. PomB S27, ein polarer Rest direkt über D24, kann die Zugänglichkeit des Lösungsmittels verbessern (Abb. 3d). Darüber hinaus können die hydrophoben Reste, die sich an der periplasmatischen Grenzfläche von PomA und PomB befinden, den Rückfluss des Ions in den periplasmatischen Raum blockieren und die Statoreinheit stabilisieren, indem sie verhindern, dass sie während des Verweilens der Statoreinheit auf dem auseinanderfällt Rotor (Abb. 4a). Eine aktuelle Studie zeigte, dass, wenn E. coli MotAB durch ein manipuliertes PomAB (PomB PGB ersetzt durch E. coli MotB PGB) ersetzt wird, in einer Umgebung mit niedrigem Na+-Gehalt das manipulierte PomAB schnell Mutationen erwerben kann, die die Beweglichkeit der Bakterien wiederherstellen60 und die Anpassungsfähigkeit widerspiegeln der Statoreinheit. Dies steht im Einklang mit unseren Ergebnissen, bei denen diese Mutationen im VaPotAB (PomB PGB ersetzt durch S. enterica MotB PGB) der Statoreinheit einen Funktionsgewinn-Phänotyp in S. enterica verliehen (ergänzende Abbildung 14a – b). Die meisten dieser Mutationsstellen befinden sich in der Nähe des Ionenselektivitätshohlraums (ergänzende Abbildung 14c–d), einschließlich PomB G20, L28 und PomA L183, und können bei Mutation die Ionenspezifität modulieren, was es der Statoreinheit wahrscheinlich ermöglicht, sowohl Na+ als auch H+ zu verwenden Kopplung von Ionen. Bemerkenswert ist, dass in der H+-gesteuerten Statoreinheit C. jejuni MotAB die äquivalente Stelle von PomA L183 Phenylalanin (CjMotA186) ist, dessen Seitenkette in der aktivierten Statoreinheit zwei Konformationen annimmt, was die Effizienz der H+-Translokation beeinflusst33. Wir haben auch festgestellt, dass PomB L36Q einen Funktionsgewinn-Phänotyp aufweist. In der verstopften PomAB-Struktur interagiert die PomB-Kette 1 L36 hydrophob mit dem Plug-Motiv F47 der PomB-Kette 2 (nicht PomB-Kette 2 L36 mit der PomB-Kette 1 F47 aufgrund der asymmetrischen Anordnung) (ergänzende Abbildung 12c – d). Die L36Q-Mutation verringert möglicherweise die Bindungsenergie des Plug-Motivs und macht die Statoreinheit aktiver. Darüber hinaus ist es unwahrscheinlich, dass PomB L36 den zuvor vorgeschlagenen Ionentranslokationsweg auskleidet, in dem es das Dehydratisierungstor mit nahegelegenen hydrophoben Resten bildet, da der L36A-Mutant die gleiche Motilität wie der Wildtyp-Phänotyp aufweist (ergänzende Abbildung 14a).

Die beobachteten CH-CI-Wechselwirkungen und die Ablösung an einer Stelle sowie die unregelmäßige fünfeckige Form der zytoplasmatischen PomA-Domäne tragen wahrscheinlich zum Prozess der Montage der Statoreinheit auf dem Rotor bei. Wir schlagen das folgende Modell für die dynamische Bindung der Statoreinheit an den Rotor vor, bei dem sich die Statoreinheit zufällig zum Rotor hin ausrichtet und die Länge der FliG-Drehmomenthelix „misst“. Sobald sowohl die Haupt- als auch die Komplementärflächen der zytoplasmatischen PomA-Domäne die FliG-Drehmomenthelix erfassen, möglicherweise durch (eine der) zwei kürzesten Stellen unter fünf, die am besten zur Länge der FliG-Drehmomenthelix passen (Abb. 5d, f), entsteht die Statoreinheit eingebaut und aktiviert wird (Abb. 6a–c). Dieser Prozess könnte durch FliL unterstützt werden, ein Membranprotein, von dem kürzlich gezeigt wurde, dass es den Stator-Rotor-Einbau verbessert und die Statoreinheit in ihrer aktivierten Form stabilisiert63,64. Während der Aktivierung liefert jede PomA-Untereinheit in der Nähe des freigeschalteten PomB-D24 ein Na+ aus dem Ionenselektivitätshohlraum, um das freigeschaltete D24 mit einem Na+ zu koppeln. Währenddessen gibt der aktivierte PomB D24 das gekoppelte Na+ frei und sorgt zusammen mit M155 für die CW-Rotation von PomA um PomB, gesehen von außerhalb der Membran. Gleichzeitig interagiert die zytoplasmatische Domäne von PomA zunehmend mit der FliG-Drehmomenthelix. Abhängig von der Konformation des C-Rings befindet sich der Rotor entweder im CCW- oder CW-Rotationsmodus (Abb. 6d).

a Eine inaktive Statoreinheit wird automatisch gesperrt. b Die inaktive Statoreinheit richtet ihre zytoplasmatische Domäne in Richtung des Rotors aus, um die FliG-Drehmomenthelix zu kontaktieren. c Das Signal aus der Wechselwirkung zwischen Statoreinheit und Rotor wird auf die periplasmatische Domäne von PomAB übertragen, wo es die Freisetzung der Plug-Motive fördert, gefolgt von der Dimerisierung und Bindung der PomB-PGB-Motive an die Peptidoglycanschicht. PomAB wird aktiviert. d Im aktivierten PomAB passiert ein Natriumion (dargestellt durch eine Kugel mit einem +-Symbol) den PomA-Selektivitätsbindungsfilter und bindet an PomB Asp24, wodurch eine CW-Rotation von PomA um PomB ausgelöst wird. Der Rotor könnte sich entweder im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn drehen, je nachdem, wie er mit der Statoreinheit interagiert. e Demontage der Statoreinheit vom Rotor, wenn das externe Drehmoment verringert wird.

Angesichts der Tatsache, dass Statoreinheiten ständig um den Rotor herum auf- und abgebaut werden, abhängig von der Anforderung der externen Last, könnte die asymmetrische PomA-Zytoplasmadomäne auch für die Ablösung der deaktivierten Statoreinheit vom Rotor von Vorteil sein. Wenn die äußere Belastung verringert wird, was wahrscheinlich dazu führt, dass sich das PGB-Motiv des PomB von der Zellwand löst, binden die Plug-Motive der Statoreinheit wieder an ihre Hemmstellen. Dieses Signal wird auf die zytoplasmatische Domäne der Statoreinheit übertragen, was zu deren Asymmetrie führt und die Wechselwirkungen zwischen der Statoreinheit und dem Rotor schwächt, wodurch die Trennung der Statoreinheit vom Rotor gefördert wird (Abb. 6e). Das vorgeschlagene Modell erinnert an den kürzlich vorgeschlagenen „Catch-Bond“-Mechanismus, bei dem die Wechselwirkung/Bindung bei reduzierter Kraft schwächer wird und durch Rotation des Rotors verstärkt wird65,66. Allerdings ist die atomare Struktur des gesamten Flagellenmotors mit den zusammengebauten Statoreinheiten erforderlich, um den Mechanismus des Rotoreinbaus der Statoreinheit vollständig zu verstehen, und ob die asymmetrische PomA-Zytoplasmadomäne während der Aktivierung symmetrisch wird, muss noch weiter untersucht werden (ergänzende Abbildung 15a – b). .

Zusammenfassend präsentieren wir die Strukturen von VaPomAB sowohl in Detergens- als auch in Lipidumgebungen. Die Kryo-EM-Karten liefern nicht nur einen detaillierten Strukturaufbau der Na+-getriebenen Statoreinheit, sondern ermöglichen uns auch die Zuordnung der Ionenbindungsstellen, was uns wiederum ermöglicht, den rätselhaften Mechanismus der Ionenselektivität der Statoreinheit zu untersuchen. Unsere Strukturanalyse und Funktionsexperimente belegen, dass es sich bei der Statoreinheit um einen unidirektional rotierenden CW-Motor handelt. Dies wird durch einen hydrophoben Richtungsrotations-„Verstärkungspunkt“ erreicht. Die Organisation der PomB-Plug-Motive und die Entdeckung des C-terminalen Helixmotivs von PomA erweitern unsere Sicht auf die Aktivierung der Statoreinheit und den Rotoreinbau weiter.

Die für VaPomAB kodierende DNA-Sequenz wurde aus Vibrio alginolyticus (ATCC 17749) amplifiziert und in einen modifizierten pET-Vektor subkloniert, der einen C-terminalen Twin-Strep-Tag enthielt. Eine 3C-Protease-Spaltstelle des humanen Rhinovirus (HRV) (GTLEVLFQGPGGS) wurde zwischen dem PomB-Plug-Motiv und der Peptidoglycan-Bindungsdomäne (zwischen den Resten Gln95 und Gln96) eingefügt. Der PomAB-Komplex wurde in E. coli OverexpressTM C43(DE3)-Zellen (LuBioScience GmbH) exprimiert. Die Zellen wurden in 8 l LB-Medium, ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin, bei 37 °C kultiviert und die Proteinexpression wurde mit 0,5 mM IPTG bei OD600 0,6 induziert. Die Zellen wurden vor der Ernte weitere 16 Stunden bei 20 °C inkubiert. Das Zellpellet wurde in Puffer A (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl) mit 30 μg/ml DNase I und 50 μg/ml Lysozym resuspendiert und 30 Minuten bei 4 °C inkubiert, bevor es durch einen EmulsiFlex-Puffer geleitet wurde. C5-Homogenisator mit 15.000–20.000 Pfund-Kraft pro Quadratzoll. Anschließend wurden die Membranen 1 Stunde lang bei 18.000 × g sedimentiert und nach dem Schockgefrieren mit flüssigem Stickstoff bei –20 ° C gelagert.

Zur Proteinreinigung wurden die Membranen in Puffer A, ergänzt mit 2 % (w/v) Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG), 10 % Glycerin und Proteaseinhibitoren (Proteaseinhibitor-Cocktailtabletten, EDTA-frei, Roche Diagnostics GmbH) für 2 solubilisiert h bei 4 °C unter Schütteln auf einer Schaukelplattform und dann 30 min lang bei 18.000 × g ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Schwerkraftflusssäule gegeben, die 2 ml Strep-Tactin® Superflow®-Harz (IBA) enthielt, das mit Waschpuffer (Puffer A mit 10 % Glycerin und 0,005 % LMNG) voräquilibriert war. Die Harze wurden fünfmal mit 4 Säulenvolumina Waschpuffer gewaschen und das mit Strep markierte Protein wurde mit Elutionspuffer (Puffer A, 10 % Glycerin, 0,005 % LMNG und 10 mM Desthiobiotin) eluiert. Der Proteinkomplex wurde dann konzentriert, bis ein Volumen von 0,5 ml erreicht war. HRV-3C-Protease wurde der VaPomAB-Probe mit einem Protein:Protease-Verhältnis von 5:1 (Gew./Gew.) zugesetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Probe wurde auf eine Superose® 6 Erhöhung 10/300 GL (Merck)-Säule geladen, voräquilibriert mit Puffer A mit 0,002 % LMNG. Die dem Proteinkomplex entsprechenden Peakfraktionen wurden unter Verwendung eines Zentrifugalfilters mit PES-Membran (Sartorius) auf etwa 16–20 mg/ml konzentriert und sofort zur Herstellung von Kryo-EM-Probengittern verwendet.

Um VaPomAB in Lipid-Nanodiscs mit MSP1D1 zu rekonstituieren, wurden 500 μl 2 mg/ml gereinigtes VaPomAB ohne PomB PGB mit polaren Lipiden von E. coli und MSP1D1 in einem Molverhältnis von 1:156:6,25 (VaPomAB:Lipide:MSP1D1) gemischt. Die Reaktion wurde 5 Minuten lang bei 4 °C und leichtem Rühren inkubiert. Biokügelchen (300 mg pro ml Reaktion) wurden zugegeben und über Nacht inkubiert, um das Detergens zu entfernen. Biokügelchen wurden am nächsten Tag mit einem PVDF-0,22-μm-Zentrifugalfilterröhrchen (Durapore) herausgefiltert. Die Probe wurde dann in eine Superose® 6-erhöhung 10/300 GL (Merck)-Säule injiziert, die mit Puffer A voräquilibriert war. Die Peakfraktionen, die dem Proteinkomplex in Lipid-Nanoscheiben von MSP1D1 entsprachen, wurden gepoolt, konzentriert und für die Kryotherapie verwendet - Vorbereitung der EM-Gitter.

Um VaPomAB mit Saposin in Lipid-Nanoscheiben zu rekonstituieren, wurden 300 μl 6 mg/ml gereinigtes VaPomAB in voller Länge (ohne Protease-Insertion) mit polaren Lipiden von E. coli (10 mM; 200 μl) gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Saposin (6,7 mg/ml; 350 μl) wurde der Reaktion zugesetzt und 2 Minuten lang inkubiert. Das Molverhältnis von PomAB, Lipiden und Saposin betrug jeweils 1:300:35. Die Reaktion wurde mit 2 ml Puffer A verdünnt, um die Rekonstitution zu starten, und weitere 30 Minuten auf Eis inkubiert. 700 mg Biokügelchen wurden hinzugefügt und über Nacht inkubiert, um das Detergens zu entfernen. Die übrigen Schritte waren die gleichen wie bei der Rekonstitution von VaPomAB in MSP1D1-Nanoscheiben.

Um die bevorzugte Partikelorientierung aufzubrechen, wurden der Probe vor der Gittervorbereitung 0,0125 % CHAPSO (Endkonzentration) zugesetzt. 2,7 µl frisch gereinigte Probe wurden auf glimmentladene (30 s, 5 mA) Gitter (Quantifoil R 0,6/1 300 Mesh Cu oder Ultrafoil 0,6/1 300 Mesh Au) aufgetragen und mit einem Vitrobot Mark IV in flüssiges Ethan tauchgefroren (FEI, Thermo Fisher Scientific) mit den folgenden Parametern: 4 °C, 100 % Luftfeuchtigkeit, 7 s Wartezeit, 4–4,5 s Blot-Zeit und eine Blot-Kraft von 25. Filme wurden mit dem halbautomatischen Aufnahmeprogramm EPU gesammelt (FEI, Thermo Fisher Scientific) auf einem Titan Krios G2-Mikroskop, das bei 300 keV betrieben wird, gepaart mit einem Falcon 3EC-Direktelektronendetektor (FEI, Thermo Fisher Scientific). Die Bilder wurden im Elektronenzählmodus bei 96.000-facher Vergrößerung mit einer kalibrierten Pixelgröße von 0,832 Å und einem Defokusbereich von 0,8–3 µM aufgenommen. Für die in LMNG gereinigte VaPomAB-Probe wurden 6467 Mikroaufnahmen gesammelt, wobei jede Mikroaufnahme 40 Bilder und eine Gesamtexpositionsdosis von 37,98 (e/Å2) enthielt. Für die in Saposin-Nanoscheiben rekonstituierte VaPomAB-Probe wurden 3927 Mikroaufnahmen gesammelt, wobei jede Mikroaufnahme 40 Bilder und eine Gesamtexpositionsdosis von 37 (e/Å2) enthielt. Für die VaPomAB MSP1D1-Probe wurden 5450 Mikroaufnahmen gesammelt, wobei jede Mikroaufnahme 40 Bilder und eine Gesamtbestrahlungsdosis von 40 (e/Å2) enthielt.

Um die Bilddatenverarbeitung konsistent zu halten, wurden alle Datensätze mit cryoSPARC Version 3.3.2 und Version 4 verarbeitet, sofern nicht anders angegeben. Die Patch-Bewegungskorrektur wurde verwendet, um die Rahmenbewegung und Probenverformung (lokale Bewegung) abzuschätzen und zu korrigieren. Die Schätzung der Patch-Kontrastfunktion (CTF) wurde verwendet, um den lokalen CTF an mikroskopische Aufnahmen anzupassen. Mikroaufnahmen wurden manuell kuratiert, um die schlechten zu entfernen (relative Eisdicke dicker als 1,05 und CTF-Wert schlechter als 3,2 Å für den LMNG-Datensatz; relative Eisdicke dicker als 1,1 und CTF-Wert schlechter als 5 Å für den MSP1D1-Nanodisc-Datensatz; relativ Eisdicke dicker als 1,2 und CTF-Wert schlechter als 5 Å für den Saposin-Nanodisc-Datensatz). Die Partikel wurden mit der in cryoSPARC67 implementierten Topaz-Software ausgewählt. Grundsätzlich wurde Topas-Extrakt mit einem vorab trainierten Modell mit einem vorab getesteten Partikelschwellenwert verwendet. Die Partikel wurden mit einer Boxgröße von 400 Pixeln extrahiert und per Fourier auf eine Boxgröße von 100 Pixel zugeschnitten. Doppelte Partikel wurden unter Verwendung eines Mindestabstandskriteriums von 60 Å entfernt, was bedeutet, dass der Abstand zwischen den Mittelpunkten zweier benachbarter Partikel größer als 60 Å sein sollte. Anschließend wurde eine Runde der 2D-Klassifizierung durchgeführt, gefolgt von einer Ab-initio-Rekonstruktion. Um die Schrottpartikel loszuwerden, wurde eine heterogene Veredelung eingesetzt. Die Partikel wurden mit voller Boxgröße (400 Pixel) erneut extrahiert. Eine ungleichmäßige Verfeinerung wurde mit einer dynamischen Maske angewendet, um eine Karte mit hoher Auflösung zu erhalten. Zusätzlich wurde eine lokale Verfeinerung mit einer weichen Maske rund um den VaPomAB-Komplex durchgeführt, um eine Karte mit höherer Auflösung zu erhalten. Die Anzahl der mikroskopischen Aufnahmen, die Gesamtbelichtungswerte, die Anzahl der zur endgültigen Verfeinerung verwendeten Partikel und die Kartenauflösungswerte für alle Datensätze sind in Tabelle S1 zusammengefasst.

ColabFold68 wurde verwendet, um die Struktur des PomA-Pentamers69 vorherzusagen und das Modell mithilfe von UCSF ChimeraX70 manuell an die Dichte anzupassen. Das Modell wurde in Coot71 verfeinert und PomB TM und Plug-Motiv wurden manuell modelliert. Anschließend wurde das Modell mithilfe der PHENIX-Realraumverfeinerung72 gegenüber der Karte verfeinert.

Das System wurde durch Einbetten der Kryo-EM-Struktur von PomAB in eine flache, gemischte Lipiddoppelschicht bestehend aus 16:0–18:1 Phosphatidylethanolamin (POPE) und 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylglycerin (POPG) im Verhältnis 4:1 konstruiert Verhältnis mit dem Membrane Builder-Tool des CHARMM-GUI-Webservers73. Unter Verwendung des TIP3P-Wassermodells wurde explizit Wasser hinzugefügt, und die Systemladung wurde mit Natriumionen neutralisiert und in einer kubischen Wasserbox mit 0,15 M NaCl solvatisiert. Die Größe der Box betrug 11,0, 11,0 und 11,5 nm in der x-, y- und z-Dimension, was insgesamt etwa 144.000 Atome ergab. Das Kraftfeld CHARMM36m74 wurde für das Protein und das Kraftfeld CHARMM36 Lipid75 für alle Lipidmoleküle verwendet. Beachten Sie, dass die WYF-Korrektur in das Kraftfeld einbezogen wurde, um die Beschreibung der Kation-π-Wechselwirkungen zu verbessern76. Die Temperatur wurde unter Verwendung des V-Rescale-Algorithmus mit einer Kopplungskonstante von 2 ps konstant bei 310 K und der Druck unter Verwendung des Parrinello-Rahman-Barostaten77 mit einer Zeitkopplungskonstante von 5 ps bei 1,0 bar gehalten. Für die Van-der-Waals-Wechselwirkungen wurde ein Grenzwert von 1,2 nm unter Verwendung einer Schalterfunktion ab 1,0 nm angewendet. Der Grenzwert für die kurzreichweitigen elektrostatischen Wechselwirkungen lag ebenfalls bei 1,2 nm und die langreichweitigen elektrostatischen Wechselwirkungen wurden mithilfe des Partikelnetz-Ewald-Zerlegungsalgorithmus mit einem Maschenabstand von 0,12 nm berechnet. Es wurde ein reziprokes Gitter aus 96 × 96 × 96 Zellen mit B-Spline-Interpolation 4. Ordnung verwendet. MD-Simulationen wurden mit Gromacs2021.578 durchgeführt. Es wurden zwei unabhängige Simulationen für jeweils eine µs durchgeführt. Die Analyse der MD-Trajektorien wurde mit den Tools Gromacs gmx und GROmaρs79 durchgeführt.

Die relative Differenz der freien Energie zwischen Na+ und K+ im Natriumbindungshohlraum (die rechte Bindungsstelle in Abb. 4d) wurde unter Verwendung der Methode der Störung der freien Energie80 berechnet. Für die alchemistischen Transformationen der Atomtypen wurde eine Hybridtopologie vorbereitet, die beide Ionen enthält. Um die Berechnung zu vereinfachen, wurde ein „Doppelsystem/Einzelbox“-Aufbau81 verwendet, sodass ΔΔGbindingN+→K+ in einem einzigen Berechnungssatz ermittelt werden konnte. Die alchemistischen Übergänge wurden mit dreizehn Lambda-Fenstern durchgeführt und jedes Fenster wurde 4 ns lang ausgeführt. Die Berechnung wurde dreimal wiederholt, um die Konsistenz zu bestätigen. Für die Durchführung der alchemistischen Simulationen wurde Gromacs 2021.5 verwendet und für deren Analyse wurde das GMX-Bar-Tool verwendet.

Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 (J. Roth) (ATCC 700720) wurden bei 37 °C unter Belüftung bei 180 U/min in Lysogenie-Brühe (LB-Medium) [10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Hefeextrakt] gezüchtet g/l NaCl]. Für feste Agarplatten wurden 1,5 % (Gew./Vol.) Agar-Agar hinzugefügt, alternativ wurden 0,3 % (Gew./Vol.) Agar-Agar zugesetzt, um die Schwimmmotilität zu testen. Alle in dieser Studie verwendeten Stämme sind in der Ergänzungsinformationstabelle S2 aufgeführt. Für Stämme, die ein Plasmid mit einem Resistenzmarker tragen, wurden ausgewählte Medien mit Chloramphenicol (12,5 µg/ml) ergänzt. Induktionsexperimente wurden in Gegenwart von Arabinose (0,2 %) durchgeführt.

Plasmide wurden gemäß den an anderer Stelle beschriebenen Standardklonierungstechniken konstruiert (ISBN 0879695773). Kurz gesagt wurden Rolling Circle, Around the Horn PCR und Overlap PCR angewendet, um Punktmutationen in pomA bzw. pomB zu erzeugen. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in der Ergänzungsinformationstabelle S3 aufgeführt. Zur DNA-Amplifikation wurde Q5-Polymerase und zur Verifizierung OneTaq-Polymerase (beide gekauft von NEB, Ipswich, MA, USA) verwendet. Alle Plasmide wurden durch Sequenzierung verifiziert.

Um die Schwimmmotilität von VaPotAB-Mutanten zu beurteilen, wurden Stämme in flüssiges LB-Medium, ergänzt mit Chloramphenicol, geimpft und über Nacht wachsen gelassen. 2 µl der Übernachtkulturen wurden in Weichagarplatten geimpft, die den selektiven Marker enthielten und mit oder ohne Arabinose ergänzt waren, und bei 37 °C inkubiert. Sobald ein Motilitätsaroma sichtbar war, wurden die Platten gescannt. Aus diesen Bildern wurden die Schwimmdurchmesser mit Fiji82 gemessen.

Die Abbildungen wurden mit ChimeraX 1.6.170, PyMOL 2.5.4, GraphPad Prisim 9.4.1 und Adobe Illustrator erstellt. Die vergrabene Oberfläche und die freie Solvatationsenergie wurden mit dem Online-Webserver PDBePISA83 berechnet. Der Strukturvergleich zwischen den Modellen PomAB-LMNG und PomAB-MSP1D1 wurde in Pymol durchgeführt, indem 1312 Cα-Atome ohne Ausreißerunterdrückung ausgerichtet wurden. Die elektrostatischen Potentialkarten wurden mit dem in Pymol integrierten elektrostatischen Plugin APBS84 berechnet. Kurz gesagt, das hochauflösende VaPomAB-Modell und das VaFliG AlphaFold-Modell wurden mit „pdb2pqr“85 erstellt, indem teilweise geladene und Wasserstoffe sowie fehlende Atome zugeordnet wurden. Anschließend wurden die elektrostatischen Karten mit APBS mit einem Rasterabstand von 0,5 berechnet. Die berechnete Karte wurde auf das entsprechende Molekül mit der in der Einheit KbT/e angegebenen Skala projiziert, wobei Kb die Boltzmann-Konstante darstellt, T die Temperatur in Kelvin und e die Ladung eines Elektrons ist. Wir haben in der ergänzenden Abbildung 16 bereitgestellt. Die nicht zugeschnittenen und unverarbeiteten SDS-Gele, die in der ergänzenden Abbildung 2b und den ergänzenden Abbildungen dargestellt sind. 3a und 4a.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Atomkoordinaten für VaPomAB in LMNG-Detergens und VaPomAB in MSP1D1-Nanodisc wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes PDB: 8BRD bzw. 8BRI hinterlegt. Die entsprechenden elektrostatischen Potentialkarten wurden in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) unter den Zugangscodes EMDB: EMD-16212 bzw. EMD-16215 hinterlegt. Die Karte des elektrostatischen Potenzials für VaPomAB in voller Länge in Saposin-Nanoscheiben wurde in der EMDB unter dem Zugangscode EMDB: EMD-16214 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Das Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research wird finanziell von der Novo Nordisk Foundation (NNF14CC0001) unterstützt. NMIT dankt für die Unterstützung durch den DFF-Zuschuss (8123-00002B) und den NNF Hallas-Møller Emerging Investigator Zuschuss (NNF17OC0031006). ME dankt dem Europäischen Forschungsrat (ERC) für die Unterstützung im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Vereinbarung Nr. 864971). YW würdigt die finanzielle Unterstützung durch das National Key Research and Development Program of China (Nr. 2021YFF1200404) und die Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (Nr. K20220228) sowie den Zugang zu Rechenressourcen des Information Technology Center und State Key Lab von CAD&CG, ZheJiang-Universität. HH dankt dem Postdoc R347-2020-2429 der Lundbeck Foundation für seine Unterstützung. Wir danken der dänischen Kryo-EM-Einrichtung an der Core Facility for Integrated Microscopy (CFIM) der Universität Kopenhagen sowie Tillmann Pape und Nicholas Heelund Sofos für die Unterstützung bei der Datenerfassung.

Gruppe „Strukturbiologie molekularer Maschinen“, Programm „Proteinstruktur und -funktion“, Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Fakultät für Gesundheits- und Medizinwissenschaften, Universität Kopenhagen, Blegdamsvej 3B, 2200, Kopenhagen, Dänemark

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Biodesign Center for Mechanisms of Evolution, Arizona State University, Tempe, AZ, 85287, USA

Navish Wadhwa

Max-Planck-Einheit für die Wissenschaft der Krankheitserreger, Berlin, Deutschland

Marc Erhardt

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NMIT und HH konzipierten das Projekt und gestalteten Experimente. HH exprimierte, reinigte, optimierte, bereitete Kryo-EM-Gitter vor, sammelte Kryo-EM-Daten und bestimmte die Struktur von VaPomAB und die Strukturen von VaPomAB in Nanoscheiben. MS half zu Beginn dieses Projekts bei der Proteinexpression, -reinigung und der Vorbereitung des Kryo-EM-Gitters. PFP führte den Motilitätstest durch und interpretierte die Daten zusammen mit ME. YW und ZL führten die Molekulardynamiksimulationen durch. MS, AR-E., YMY und FJOM halfen bei der Datenanalyse und Zahlenaufbereitung. NW half bei der Dateninterpretation. HH erstellte und verfeinerte die Strukturmodelle, bereitete Abbildungen vor und verfasste unter Einbeziehung aller Autoren den ersten Entwurf des Manuskripts, der dann von NMIT und ME bearbeitet wurde. Alle Autoren trugen zur Überarbeitung des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Nicholas MI Taylor.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hu, H., Popp, PF, Santiveri, M. et al. Ionenselektivität und Rotorkopplung der natriumgetriebenen Vibrio-Flagellen-Statoreinheit. Nat Commun 14, 4411 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39899-z

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Eingegangen: 15. Januar 2023

Angenommen: 04. Juli 2023

Veröffentlicht: 27. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39899-z

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