Die Verankerungsgeometrie ist ein wesentlicher Faktor bei der Bestimmung der Kinesinrichtung

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 15417 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Kinesin-14-Mikrotubuli-basierte Motoren haben einen N-terminalen Schwanz, der den katalytischen Kern an seiner Ladung befestigt, und bewegen sich normalerweise in Richtung des Minus-Endes der Mikrotubuli, während die meisten anderen Kinesine einen C-terminalen Schwanz haben und sich in Richtung des Plus-Endes bewegen. Der Verlust konservierter Sequenzen außerhalb der Motordomäne führt dazu, dass Kinesin-14 zur Plus-End-Motilität wechselt, was zeigt, dass eine N-terminale Bindung mit der Plus-End-Motilität kompatibel ist. Allerdings gibt es keine systematische Studie zur Rolle der Bindungsposition bei der Minusendmotilität. Wir untersuchten daher die Motilität von monomeren Kinesin-14, die sich nur in ihrem Bindungspunkt unterscheiden. Wir stellen fest, dass ein C-terminaler Bindungspunkt dazu führt, dass Kinesin-14 auf das Plus-Ende ausgerichtet wird, wobei die Rotationsrichtung und Steigung der Mikrotubuli in Motilitätstests denen von Kinesin-1 ähnlich sind, was darauf hindeutet, dass sowohl C-Kinesin als auch Kinesin-14 und N -Kinesin Kinesin-1 teilt eine hochkonservierte katalytische Kernfunktion mit einer intrinsischen Plus-End-Voreingenommenheit. Daher ist eine N-terminale Bindung eine der Voraussetzungen für die Minus-End-Motilität von Kinesin-14.

Die unidirektionale Bewegung von Kinesin-Motorproteinen entlang von Mikrotubuli ist für viele zelluläre Prozesse in Eukaryoten wichtig, einschließlich des Organellentransports und der Zellteilung. Im Allgemeinen bewegen sich die meisten N-Kinesine wie Kinesine-1 bis -10 und -12, bei denen sich die Motordomäne im N-terminalen Teil befindet, in Richtung Mikrotubuli-Plus-Enden, während einige C-Kinesine wie Kinesin-14 in denen sich die Motordomänen am C-terminalen Teil befinden, bewegen sich in Richtung der Minusenden der Mikrotubuli1,2. Allerdings verfügen nicht alle Kinesine über eine solche rein unidirektionale Beweglichkeit, und kürzlich wurde bei einigen Kinesinen aus Hefen und Pilzen ein Richtungswechsel beobachtet. Einige Kinesin-5s, N-Kinesine, die normalerweise zum Plus-Ende gerichtet sind, haben die bemerkenswerte Fähigkeit, sich auch zum Minus-Ende von Mikrotubuli zu bewegen und unter verschiedenen Bedingungen die Richtung zu wechseln3,4,5,6,7, während einige Kinesin-5 14 (C-Kinesin, die normalerweise auf das Minusende gerichtet sind) zeigen kontextabhängige Bidirektionalität8,9. Trotz der entgegengesetzten Endrichtung ihrer Längsbewegungen sind die katalytischen Kerne von N-Kinesinen wie Kinesin-1 und C-Kinesinen wie Kinesin-14 in ihrer 3D-Struktur und ihren Aminosäuresequenzen bemerkenswert ähnlich1,10,11. Darüber hinaus erzeugen N-Kinesine wie die Kinesine-112, -213, -314, -515, -616 und -817 sowie die C-Kinesine Kinesin-1418,19 ebenfalls ein Drehmoment, das zusammen mit ihrer Längsbeweglichkeit zu einem Drehmoment führt eine korkenzieherartige Translokation von Mikrotubuli, die über eine Reihe von Motoren gleiten, die an einer Oberfläche befestigt sind. Mit Ausnahme des prozessiven dimeren Kinesin-1, das einem einzelnen Protofilament im Mikrotubulus20 präzise folgt, treiben N-Kinesine mit Plus-Ende eine linksdrehende Korkenzieherbewegung des Mikrotubulus12 an, während Kinesin-14 mit Minus-Ende Ncd treibt eine rechtshändige Korkenzieherbewegung an18. Diese Umkehrung der Korkenzieherhandigkeit mit der Richtung legt nahe, dass die laterale Drehmoment erzeugende Komponente der Kinesin-Motilität bei beiden Motortypen genau gleich ist (ergänzende Abbildung 1)12.

Im Gegensatz zur Ähnlichkeit ihrer katalytischen Kernstruktur und -funktion haben Kinesin-1 und Kinesin-14 ihre eigenen einzigartigen Regionen neben dem C- und N-Terminus ihres katalytischen Kerns (Abb. 1a und ergänzende Abb. 2a, b). ). In Kinesin-1 erfährt eine C-terminale ~ 15 Aminosäuren lange Region namens Neck-Linker, die sich von der α6-Helix im katalytischen Kern erstreckt, Konformationsänderungen, die durch Änderungen im Kinesin-Nukleotidzustand induziert werden21,22. Es wird angenommen, dass die Andockkonformation dieses Hals-Linkers an den katalytischen Kern das primäre krafterzeugende Ereignis für N-Kinesine ist. Kürzlich wurde vermutet, dass ein N-terminaler β-Strang, der sogenannte Cover-Strang, der aus dem Kinesin-1-Motorkern herausragt, mit dem Neck-Linker interagiert und ein „Cover-Neck-Bündel“ bildet, das die Krafterzeugung entlang beider Mikrotubuli moduliert Längsachsen23,24 und kurze Querachsen25. Der Mechanismus zur Erzeugung der Andockkraft des Neck-Linkers bleibt jedoch nicht bei allen N-Kinesinen erhalten, da einigen N-Kinesinen wie Kinesin-6 und -10 typische Neck-Linker-Regionen fehlen26,27. Im Gegensatz zu den N-Kinesinen besitzen die C-Kinesine Kinesine-14 eine einzigartige α-helikale Struktur, die sogenannte Halshelix, die direkt mit dem N-Terminus des β1-Faltblatts im katalytischen Kern verbunden ist und in allen Kinesinen hoch konserviert ist -14 Mitglieder28. Es wurde angenommen, dass ein Rotationsschwung der Halshelix für die Krafterzeugung und die Minus-End-Richtung in Kinesinen-14 verantwortlich ist, was dem Hebelarmschwung entspricht, der für Aktin-basierte Myosin-Motorproteine vorgeschlagen wurde29, obwohl der Nukleotidzustand, in dem die Hals-Helix-Schwingungen bleiben umstritten19,30,31,32. Darüber hinaus enthält Kinesin-14 auch eine C-terminale kurze Region, die als Halsmimik bezeichnet wird und aus der α6-Helix herausragt. Obwohl das Neck-Mimetikum auf Aminosäureebene wenig Ähnlichkeit mit dem Neck-Linker von N-Kinesinen aufweist, enthält es mehrere basische und eine hydrophobe Aminosäure, die in Kinesin-14s33 hochkonserviert sind. Das Halsmimetikum wurde in kristallographischen oder kryoelektronenmikroskopischen Strukturen von Wildtyp-Kinesin-14s Drosophila melanogaster Ncd30,34 oder Saccharomyces cerevisiae Kar335 nicht nachgewiesen, wurde jedoch in der Struktur des Kinesin-14-Mitglieds KCBP (Kinesin-ähnliche Calmodulinbindung) nachgewiesen Protein), wobei die C-terminale Region einschließlich des Hals-Mimetikums auf die gleiche Weise an den katalytischen Kern andockte wie der Hals-Linker in N-Kinesinen36. Bei Ncd mit der Einzelmutation T436S wurde auch gezeigt, dass die ersten drei Reste der Hals-Mimikregion an den katalytischen Kern andocken31. Biochemische Tests und Motilitätstests deuten auch darauf hin, dass das Hals-Mimetika von Ncd die Bindungsaffinität von Ncd an Mikrotubuli und die auf das Minus-Ende gerichtete Motilität regulieren kann33. Diese Studien legen nahe, dass die C-terminale Hals-Mimikregion in C-Kinesinen möglicherweise auch an der Krafterzeugung für die auf das Minus-Ende gerichtete Motilität beteiligt ist, ähnlich wie der Hals-Linker von N-Kinesinen für die auf das Plus-Ende gerichtete Motilität .

Beobachtung der Direktionalität von N- oder C-verknüpftem monomerem Kinesin-14. (a) Die 3D-Struktur von Ncd (PDB: 5W3D)43 und Kinesin-1 (PDB: 4HNA)44. Der katalytische Kern (Ncd, orange; Kinesin-1, cyan) weist eine hohe strukturelle Homologie zwischen den Kinesinen auf. Die N-terminale Halshelix von Ncd (gelb) und der Deckstrang von Kinesin-1 (blau) weisen geringe strukturelle Homologie auf. Das C-terminale Hals-Mimetikum von Ncd (rosa) und der Hals-Linker von Kinesin-1 (lila) weisen geringe strukturelle Homologie auf. (b) Monomere Konstrukte, die in dieser Studie verwendet werden. Alle Konstrukte (Kinesin-14s, Ncd-Mutante und Kinesin-1-Ncd-Chimäre) weisen entweder am N-Terminus oder am C-Terminus ein biotinyliertes Peptid (Avi-Tag) auf. Das NcdRan14-Konstrukt weist eine Insertion von zufälligen 14 Resten GESGAKQGEKGESG (grün) zwischen Halshelix und katalytischem Kern auf, entsprechend dem dimeren ncd-ran12 des vorherigen Berichts28. Die nKn664-Chimäre besteht aus Ncd K325-N348 – RnKIF5C I9-K320 – Ncd A664-K70038 und entspricht der dimeren Chimäre NcdKHC1 des vorherigen Berichts . (c,d) Schema eines monomeren Kinesin-14, das über seinen N-Terminus (c) bzw. C-Terminus (d) am Streptavidin-beschichteten Substrat verankert ist.

Chimären, die Teile des C-Kinesins Kinesin-14 Ncd mit Teilen eines Kinesin-1 fusionieren, wurden verwendet, um zu identifizieren, welche der Sequenzmerkmale die Kinesin-Richtung bestimmen. Ncd-Hals-Helix- und Neck-Mimic-Regionen wurden zusammen mit 5 Aminosäuren (AASVN) des katalytischen Kerns an die N- bzw. C-Termini eines katalytischen N-Kinesin-Kinesin-1-Motorkerns fusioniert, wobei das Konstrukt darüber verankert wurde N-Terminus zur Substratoberfläche (Ergänzende Abbildungen 2 und 3). Sowohl die dimere NcdKHC137- als auch die monomere nKn66438-Version des Konstrukts weisen eine Mikrotubuli-Minus-End-Richtung auf, wodurch die normale Plus-End-Polarität der Kinesin-1-Bewegung umgekehrt wird (ergänzende Abbildungen 2c, d und 3). Wenn jedoch Mutationen im N-terminalen Hals-Helix-Katalysator-Kern-Übergang (NcdKHC5) vorhanden waren, änderte sich die Richtung nicht und NcdKHC5 behielt die Plus-End-Direktionalität von Kinesin-137 bei (Ergänzende Abbildungen 2e und 3). Sablin et al. fanden auch diese Mutation der konservierten Reste der Halshelix in einem dimeren Ncd-Konstrukt (ncd-ran12), bei dem die Halshelix durch Randomisierung von 12 Resten mutiert und der N-Terminus in einem Motilitätstest an der Oberfläche verankert wurde war ein langsamer Motor mit Plus-Endrichtung, der die normale Minus-Endrichtung von Ncd28 umkehrte (Ergänzende Abbildungen 2j und 3). Somit sind sowohl die Halshelix als auch ihre Verbindung zum Motorkatalysator wichtige Faktoren bei der Bestimmung der Minus-End-Richtung.

Die Strukturanalyse eines auf das Minus-Ende gerichteten chimären Monomerkonstrukts (nKn664) zeigte, dass die nukleotidabhängigen Konformationsänderungen des Hals-Mimetikums, das sich in der Nähe des Switch-II-Clusters befindet, und seine Assoziation mit der N-terminalen Hals-Helix gekoppelt sind ATP-Hydrolyse zum Rotationsschwung der Halshelix (Ergänzende Abbildungen 2d und 3). Allerdings fehlte nKn669, wo die fünf Aminosäuren (AASVN) von Kinesin-14 an der katalytischen Kern-C-terminalen Hals-Mimik-Verbindung durch diejenigen von Kinesin-1 (GQRAK) ersetzt wurden, die Hals-Mimik-Wechselwirkung mit der Hals-Helix – katalytische Kernverbindung in nKn664. In Motilitätstests änderte sich die Direktionalität von nKn669 nicht, sodass nKn669 die Plus-End-Richtung von Kinesin-1 beibehielt (Ergänzende Abbildungen 2f und 3). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine ordnungsgemäße Funktion und Interaktion sowohl der Ncd-Halshelix als auch der Halsnachahmung erforderlich sind, um die auf das Plus-Ende gerichtete Polarität der katalytischen Kernbewegung von Kinesin-1 umzukehren und so auf das Minus-Ende gerichtet zu werden. Da sowohl der Plus-End-gerichteten Mutante (ncd-ran12) als auch den Chimären (NcdKHC5 und nKn669) der Kinesin-1-Halsabdeckungsstrang und der Kinesin-1-Halslinker fehlen, kann der katalytische Kinesin-1-Kern selbst Plus enthalten -Ende-Polaritätsdeterminanten, wie zuvor vorgeschlagen28,39, zumindest in Abwesenheit funktioneller Minus-Ende-Determinanten.

Andere Studien haben gezeigt, dass komplementäre dimere Chimären von ncd-Nkin40 und NK-141 entweder die Ncd-Halshelix oder den Kinesin-1-Deckstrang enthalten, gefolgt vom katalytischen Ncd-Kern, der an einen Teil des α6 von Kinesin-1 fusioniert ist (GMRAK oder K ) plus eine C-terminale Kinesin-1-Hals-Linker-/Stielregion, beide bewegten sich in Richtung des Plus-Endes der Mikrotubuli, wodurch die Polarität am Minus-Ende der Ncd-Bewegung umgekehrt wurde (Ergänzende Abbildungen 2g, h und 3). Beide Chimären waren in den Motilitätstests über ihren C-terminalen Kinesin-1-Stiel an der Oberfläche verankert. Wenn jedoch die dimere Chimäre NcdKHC6, bestehend aus der Ncd-Stiel-/Hals-Helix-Region und der Ncd-Kernregion des katalytischen Motors, fusioniert mit einem Teil von Kinesin-1s α6 (GRRAK) sowie der Hals-Linker-Region von Kinesin-1, an der Oberfläche verankert wurde Über seine N-terminale Halshelix behielt es die Minus-Polarität der Ncd-Bewegung bei (Ergänzende Abbildungen 2i und 3). Dies legt nahe, dass die Kombination eines Teils von Kinesin-1s α6 (GRRAK) und des Hals-Linkers von Kinesin-1 die Kombination eines Teils von Ncds α6 (AASVN) und der Hals-Nachahmung von Ncd ausreichend gut ersetzen kann, um Minus- endgerichtete Motilität. Es ist jedoch immer noch unklar, ob das Ncd-Halsmimetikum den Kinesin-1-Halslinker ausreichend gut ersetzen kann, um ihn für mehr endseitige Beweglichkeit zu ersetzen, wenn das Ncd-Halsmimetikum zur Verankerung des katalytischen Kerns über eine C-terminale Oberfläche verwendet wird Bindung, oder wenn dies eine spezifische Funktion der konservierten Neck-Linker-Sequenz ist. Daher bleibt die funktionelle Äquivalenz von Hals-Linker und Hals-Mimik unklar, und insbesondere die Fähigkeit des Hals-Mimiks, als „wirksamer“ Hals-Linker zu fungieren, um die Plus-End-gerichtete Motilität zu unterstützen, wenn der Hals-Mimik aktiviert ist direkt auf der Substratoberfläche verankert ist, wurde noch nie untersucht.

Das auffälligste Strukturmerkmal der Kinesin-14-Familie minus-End-gerichteter Motoren ist, dass sie alle C-terminale Motoren sind, während die Plus-End-gerichteten Kinesine-1 N-terminal sind. Darüber hinaus wurde in den Richtungsumkehrstudien unter Verwendung von Chimären die Minus-Endrichtung nur in N-terminal verankerten Konstrukten beobachtet (siehe ergänzende Abbildungen 2c, d, i und 3 und Lit. 37, 38), während in beiden eine Plus-End-Motilität auftrat N- und C-terminal verankerte Konstrukte (siehe ergänzende Abbildungen 2e, f, g, h, j und 3 und Ref. 28, 37, 38, 40, 41), was manchmal zu der Annahme geführt hat, dass die Rolle der Verankerung Geometrie ist offensichtlich. In diesen Studien wurde der Effekt der Verankerungsgeometrie jedoch nie unabhängig von den Sequenzen untersucht, die den katalytischen Motorkern umgeben. Daher enthielten alle N-terminal verankerten Konstrukte mit zum Minus-Ende gerichteter Polarität eine Halshelix, während die C-terminal verankerten Konstrukte Hals-Linker-Sequenzen enthielten. Jüngste Beobachtungen der Umkehrung einiger nativer Kinesine haben auch Fragen zur Rolle der Verankerung bei der Richtungsbestimmung aufgeworfen. Die bidirektionale Motilität der doppelköpfigen Kinesin-14 KlpA9 und Kar38 zeigt, dass die Verankerung des N-Terminus sowohl mit der Plus- als auch der Minus-End-gerichteten Motilität in den nativen C-Kinesinen kompatibel ist, während native doppelköpfige oder vierköpfige Kinesine vorhanden sind N-Kinesin Kinesin-5s3,4 kann sowohl Minus- als auch Plus-End-gerichtete Motilität aufweisen, was zeigt, dass andere Kinesin-Geometrien potenziell mit der Minus-End-Motilität kompatibel sind. Zumindest bei einigen Kinesin-5s, bei denen dimere oder tetramere Konstrukte bidirektional waren, zeigten die Monomerkonstrukte nur eine robuste, auf das Plus-Ende gerichtete Beweglichkeit5,42, was auf einen Schaltmechanismus hindeutet, der mindestens zwei Kinesin-Köpfe erfordert. Das C-terminale doppelköpfige Kinesin-14-KlpA-Konstrukt enthält eine zusätzliche Mikrotubuli-Bindungsstelle im Stiel9. Die Richtung wird durch den Motor bestimmt und der Stiel bindet entweder an dieselben oder an verschiedene Mikrotubuli, was auf einen möglichen Zusammenhang mit der Verankerungsgeometrie schließen lässt, da bei Entfernung der zweiten Mikrotubuli-Bindungsstelle das KlpA nur zum Minusende gerichtet wird. Daher bleibt die Rolle der Verankerungsgeometrie und insbesondere die Voraussetzung für die N-terminale Verankerung zur Erzeugung der Minus-End-Motilität bei nativem Kinesin-14 unklar.

In dieser Studie haben wir die Rolle der Verankerungsgeometrie bei der Bestimmung der nativen einköpfigen Kinesin-14-Richtung und die Fähigkeit des Kinesin-14-Halsmimetikums untersucht, den Halslinker bei der Plus-End-gerichteten Motilität zu ersetzen, wenn der Hals- Mimik ist am Untergrund verankert. Um die Rolle der Ankergeometrie von anderen Faktoren zu trennen, haben wir Monomerkonstrukte verwendet, um zwischen den Aktivitäten der einzelnen Köpfe und der Rolle der relativen Wechselwirkungen der Köpfe im Dimer zu unterscheiden. Minimale Konstrukte, die nur aus dem katalytischen Kern, der Hals-Helix und dem Hals-Mimetika von drei verschiedenen Kinesin-14s bestehen, wurden mit entweder einem N- oder C-terminalen Affinitätstag zur Verankerung des Kinesins erstellt. Wir untersuchten die Richtung der Mikrotubuli-Gleit- und Korkenzieherbewegung in Mikrotubuli-Motilitätstests. N-terminal verankerte Kinesin-14-Monomerkonstrukte waren wie zuvor berichtet am Minus-Ende gerichtet30. Wenn jedoch C-Kinesin-Kinesin-14 über ihre C-terminale Hals-Mimikregion an einer Substratoberfläche befestigt werden, kehren sie ihre Richtung um und werden mit einer linksdrehenden Korkenzieherbewegung nach Plus-Ende gerichtet. Die Händigkeit und Ganghöhe des Mikrotubuli-Korkenziehers sind die gleichen, die bei echter N-Kinesin-monomerer Kinesin-1- und Kinesin-5-gesteuerter Mikrotubuli-Korkenziehermotilität beobachtet werden15, was auf eine starke Erhaltung der katalytischen Kernaktivität zwischen N-Kinesin und C-Kinesinen hinweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass zusätzlich zu den zuvor identifizierten Hals-Helix- und Hals-Mimik-Regionen37,38 eine N-terminale Verankerung erforderlich ist, um eine auf das Minus-Ende gerichtete Motilität der Mikrotubuli zu erzeugen. Darüber hinaus tritt dieser Effekt bei monomeren Kinesinen auf, was darauf hindeutet, dass der Mechanismus nicht von den relativen Kopfgeometrien der Dimere abhängt und die konservierte C-Kinesin-Konfiguration der Kinesin-14-Familie erklärt.

Native Kinesin-14-Motorproteine haben eine gemeinsame Fähigkeit zur Mikrotubuli-Minus-End-Richtung und eine charakteristische Struktur, wobei der Kinesin-Schwanz über eine Hals-Helix-Struktur mit dem N-Terminus des konservierten katalytischen Kerns verbunden ist, während der C-Terminus einen Hals aufweist -Mimic-Region, die sich dort befindet, wo der Neck-Linker die Motordomäne mit den C-terminalen Stiel- und Schwanzdomänen anderer N-Kinesine verbindet (Abb. 1a). Obwohl die Halshelix und die Halsnachahmung für die Motilität am Minusende erforderlich sind37,38, bleibt die Rolle der N-terminalen Verankerung bei der Bestimmung der Richtung von Kinesin-14-Motoren unklar. Um die Rolle der Substratanbindung bei der Bestimmung der Direktionalität zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Konstrukten erstellt, die eine minimale Motordomäne aus einem Kinesin-14 mit demselben Ankertag an ihrem N- oder C-Terminus umfassen. Um Motorkopf-Wechselwirkungen in dimeren Konstrukten auszuschließen, wurden die minimalen motorischen Domänen von Monomer Kinesin-14 von Drosophila melanogaster Ncd, 325–700 aa18; Saccharomyces cerevisiae Kar3, 363–729 aa45; oder Aspergillus nidulans KlpA, 398–770 aa9, wurden entweder an ihrem N-Terminus (BP-Ncd325, BP-Kar363, BP-KlpA398) oder am C-Terminus (Ncd325-BP, Kar363) mit einem biotinylierten Peptid (avi-tag)46 fusioniert -BP, KlpA398-BP) (Abb. 1b und ergänzende Abb. 3). Diese Konstrukte ermöglichten es uns, die gleichen Kinesin-14-Monomere entweder über ihre Halshelix am N-Terminus der Motordomäne (Abb. 1c) oder über das Hals-Mimetikum am C-Terminus an ein Streptavidin-beschichtetes Substrat zu binden (Abb. 1d). Bei der N-terminalen Befestigung ist die Halshelix, von der vorgeschlagen wurde, dass sie schwingt, um die Kraft am Minusende zu erzeugen, an der Oberfläche befestigt und kann jede erzeugte Kraft übertragen30, während bei der C-terminalen Befestigung die N-terminale Halshelix an der Oberfläche befestigt ist. Die Helix ist in Lösung frei und es ist nicht zu erwarten, dass eine Schwingbewegung der Halshelix direkt eine Kraft auf den Motor ausübt.

Wir untersuchten zunächst die Längsdirektionalität der N-verknüpften und C-verknüpften Kinesin-14-Monomerkonstrukte (Ncd325, Kar363 und KlpA398) mithilfe eines in vitro polaritätsmarkierten Mikrotubuli-Gleittests (Abb. 2). Rasen aus entweder N-verknüpften Kinesin-14 Ncd325-, Kar363- oder KlpA398-Konstrukten trieben das Gleiten der Mikrotubuli mit den schwachen Plus-Enden voran, was auf eine auf das Minus-Ende gerichtete motorische Aktivität hinweist (Abb. 2b, d, f und Zusatzfilm 1). stimmt mit früheren Berichten überein9,30,45. Bemerkenswerterweise fanden wir heraus, dass Rasen aus C-verknüpften Kinesin-14 Ncd325-, Kar363- oder KlpA398-Konstrukten das Gleiten von Mikrotubuli mit den hellen Minus-Enden vorantreiben, was auf eine auf das Plus-Ende gerichtete motorische Aktivität hinweist, ähnlich wie bei Kinesin-1 (Abb. 2c, e,g und Zusatzfilm 1), wobei ihre normale Minus-End-Richtung in Längsrichtung umgekehrt wird.

Polaritätsmarkierte Mikrotubuli-Gleittests, gesteuert durch N- oder C-verknüpfte Monomer-Kinesine. (a) Schema des In-vitro-Polaritätsmarkierten Mikrotubuli-Gleittests. Einköpfige Kinesine, die mit einem biotinylierten Tag (avi-tag) fusioniert sind, werden über eine Biotin-Streptavidin-Bindung an biotinyliertem BSA verankert. (b–g) Typische Kymographen des polaritätsmarkierten Mikrotubuli-Gleitens, angetrieben durch N-verknüpftes Monomeres Ncd (b), Kar3 (d), KlpA (f) und C-verknüpftes Monomeres Ncd (c), Kar3 (e), KlpA ( g) werden angezeigt. N-verknüpfte, monomere Kinesine-14 gleiten durch Mikrotubuli mit ihren dunklen Plus-Enden nach vorne, was auf eine auf das Minus-Ende gerichtete motorische Aktivität hinweist, wohingegen C-verknüpfte, monomere Kinesin-14 mit ihren hellen Minus-Enden nach vorne gleiten, was auf eine auf das Plus-Ende gerichtete Motoraktivität hinweist Aktivität. (h,i) Typische Kymographen des polaritätsmarkierten Mikrotubuli-Gleitens, angetrieben durch die Ncd-Mutante NcdRan14, werden gezeigt. Sowohl N- (h) als auch C- (i) verknüpfte, monomere Kinesine gleiten durch Mikrotubuli, wobei ihre hellen Minus-Enden vorangehen, was auf eine auf das Plus-Ende gerichtete motorische Aktivität hinweist. Die Pluszeichen (+) und Minuszeichen (−) beziehen sich auf das Plus- bzw. Minus-Ende der Mikrotubuli.

Um festzustellen, ob die Konfiguration des Mikrotubuli-Gleittests, bei dem die Kinesine stationär und am Kammersubstrat verankert sind, die Kinesinbewegung beeinflusst, haben wir auch die Richtungsabhängigkeit von N-verknüpften und C-verknüpften Kinesin-14-Monomerkonstrukten (Ncd325, Kar363 und KlpA398) untersucht ) durch Anbringen mehrerer Motoren an Quantenpunkten (QDs) und Ermöglichen der Bewegung der Motoren und QDs entlang polaritätsmarkierter Mikrotubuli, die auf dem Substrat immobilisiert sind (Abb. 3a). QDs, die N-verknüpftes Kinesin-14 (Ncd325, Kar363 und KlpA398) trugen, bewegten sich erneut in Richtung der Minusenden der Mikrotubuli, während sich C-verknüpfte Kinesin-14 (Ncd325) immer noch in Richtung der Plusenden bewegten (Abb. 3b – d und Tabelle 2 und Ergänzung). Film 2). C-verknüpftes Kar363 und KlpA398 zeigten keine stabile unidirektionale Bewegung entlang der Mikrotubuli, wahrscheinlich aufgrund ihrer extrem geringen mechanischen Prozessivität. Diese Daten zeigen deutlich, dass die Direktionalität in Kinesin-14-Monomeren nicht von der Assay-Geometrie oder den besonderen Kräften abhängt, die in Mikrotubuli-Gleitassays wirken, sondern stattdessen davon abhängt, welcher Terminus der Kinesin-14-Motordomäne an das Substrat gebunden ist. Für alle drei getesteten Kinesin-14-Katalysatorkerne erzeugt die Kopplung über die N-terminale Halshelix erwartungsgemäß eine Minus-End-Richtung, während die Kopplung über die C-terminale Hals-Nachahmung die Richtung umkehrt und eine auf das Plus-Ende gerichtete Motilität erzeugt.

QD-Assay von N- oder C-verknüpftem Ncd325-Monomer. (a) Schema des Quantenpunkt-Assays (QD). Mit Streptavidin beschichtete QDs, die über eine N- oder C-terminale Avi-Tag- und Biotin-Streptavidin-Verknüpfung mit Avi-Tag-fusionierten Ncds verbunden sind, bewegen sich auf polaritätsmarkierten Mikrotubuli. (b,c) Sequentielle Bilder von QDs, die sich auf polaritätsmarkierten Mikrotubuli bewegen. QD-BP-Ncd325 (rote Pfeilspitze, b) bewegt sich zum hellen Minus-Ende des Mikrotubulus und Ncd325-BP-QD (gelbe Pfeilspitze, c) zum dunklen Plus-Ende des Mikrotubulus. (d) Ein Histogramm der Motilitätsgeschwindigkeiten eines QD, das mit N-verknüpftem Ncd-Monomer (grau) und C-verknüpftem Ncd-Monomer (schwarz) beschichtet ist. Die mittleren Geschwindigkeiten für QD-BP-Ncd325 und Ncd325-BP-QD betragen − 37 ± 16 nm s−1 (Mittelwert ± SD, n = 171) und + 63 ± 20 nm s−1 (Mittelwert ± SD, n = 248). , jeweils. Die Pluszeichen (+) und Minuszeichen (−) beziehen sich auf das Plusende und das Minusende des Mikrotubulus.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Verankerung der Motordomäne über den N-Terminus entscheidend für die Minus-End-gerichtete Motilität in Kinesin-14-Motoren ist. Sablin et al. haben berichtet, dass ein mutierter ncd-ran12, bei dem 12 Aminosäuren der Halshelix zwischen dem N-Terminus des Motors und dem Schwanz eines dimeren Ncd-Konstrukts durch 12 randomisierte Aminosäuren ersetzt werden, seine Richtung vom Minus-Ende zum Minus-Ende ändert eine langsame, auf das Plus-Ende gerichtete Motilität28. Es war jedoch unklar, ob dies auf Veränderungen in der Interaktion der Köpfe im Dimer oder auf Veränderungen in der Funktion der einzelnen Köpfe zurückzuführen war. Beispielsweise könnte es der Austausch von 12 Aminosäuren ermöglicht haben, dass sich die nicht gebundene Motordomäne des zweiköpfigen Ncd in Richtung des Plus-Endes der Mikrotubuli neigte, was zu einer Direktionalität am Plus-Ende führte. Wir haben daher zwei ähnliche Monomerkonstrukte NcdRan14 erstellt, indem wir zusätzliche 14 zufällige Aminosäuren zwischen der Halshelix und dem katalytischen Kern unserer Monomerkonstrukte eingefügt haben (Abb. 1b), wobei der Avi-Tag jeweils am N- oder C-Terminus angebracht ist Konstrukt (Abb. 1c, d und ergänzende Abb. 3). In Mikrotubuli- und QD-Motilitätstests zeigten sowohl C-verknüpftes als auch N-verknüpftes NcdRan14-Monomer eine Plus-End-gerichtete Motilität (Abb. 2h, i und Zusatzfilme 1 und 2). Dies zeigt, dass dies nicht ausreicht, obwohl das Konstrukt immer noch über seinen N-Terminus am Substrat verankert ist, und dass die direkte Kopplung der Halshelix an die Motordomäne entscheidend ist, um eine Minus-End-Richtung zu erzeugen. In Abwesenheit der präzisen Hals-Helix-Kopplung erzeugt das Monomer Ncd eine langsame, auf das Plus-Ende gerichtete Bewegung, ähnlich wie die entsprechende dimere Mutante, ncd-ran1228, und zeigt, dass dieser Effekt dem Monomerkopf innewohnt und nicht von ihm abhängt Vorhandensein des zweiten Kopfes im Dimer.

Die 5 nm s−1-Geschwindigkeit des Mikrotubuli-Gleitens, angetrieben durch unser N-verknüpftes Ncd-Monomer-Ncd-Minus-End-gerichtetes Konstrukt (Tabelle 1), ähnelt der 4 nm s−1-Geschwindigkeit, die zuvor für ein ähnliches Monomer-Ncd-Konstrukt30 berichtet wurde, was darauf hindeutet, dass die Geschwindigkeit der N-verknüpften Konstrukte in unserem Assay wurde durch den in unseren Konstrukten verwendeten Ankertag nicht gehemmt. Der Mikrotubuli-Gleittest (Tabelle 1 und Abb. 2 und ergänzende Abb. 4) und der QD-Motilitätstest (Tabelle 2 und Abb. 3 und ergänzende Abb. 5) zeigten ebenfalls einen konsistenten Trend mit Geschwindigkeiten von C-verknüpftem Kinesin-14s 1,5– 150-mal schneller im Vergleich zu N-verknüpften Kinesin-14s. Insbesondere war C-verknüpftes NcdRan14 in beiden Tests viel schneller als N-verknüpftes NcdRan14. Beide Konstrukte haben identische Motordomänen und eine Plus-Ende-Richtung, was darauf hindeutet, dass diese Unterschiede nicht einfach auf Unterschiede in der Anzahl der Motoren zurückzuführen sind, die in den an die QDs gebundenen Teams arbeiten. Unsere Ergebnisse erweitern frühere Arbeiten31,33,39,48 indem sie zeigen, dass die Hals-Nachahmung auch die Plus-End-beeinflussten Konformationsänderungen, die angeblich im katalytischen Kern von Kinesin-14 auftreten, effizienter verstärken kann, wenn die C-terminale Hals- Mimic verankert den katalytischen Motorkern am Substrat.

Um die Rolle des Ncd-Halsmimetikums zu klären, untersuchten wir die Direktionalität einer C-terminal verankerten Ncd-Kinesin-1-Chimäre nKn664-BP, die den katalytischen Kinesin-1-Kern mit Ncd-Halshelix und Halsmimetikum enthält (Abb . 1b). Zuvor hatten wir gezeigt, dass N-verknüpftes BP-nKn664 auf das Minus-Ende gerichtet ist, und wir fanden nun heraus, dass C-verknüpftes nKn664-BP dies umkehrte, um eine Plus-End-Richtung zu erzeugen (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 4e). Die Gleitgeschwindigkeit von 10 nm s−1, angetrieben durch C-verknüpftes nKn664-BP, war etwa 50-mal schneller als die von N-verknüpftem BP-nKn664, was darauf hinweist, dass das Ncd-Hals-Mimetikum den Kinesin-1-Hals-Linker in Kombination ersetzen kann mit der katalytischen Kinesin-1-Domäne. Zusammenfassend legen diese Beobachtungen nahe, dass Kinesin-1-Halslinker und Ncd-Halsmimetikum trotz ihrer Unterschiede in der Aminosäuresequenz funktionell ähnlich sind. Außerdem weist der Kinesin-Katalysatorkern selbst in der gesamten Kinesin-Superfamilie unabhängig von der natürlichen Richtung des gesamten Kinesin-Motormoleküls eine schwache mechanische Aktivität auf, die auf das Plus-Ende der Mikrotubuli gerichtet ist. Darüber hinaus kann bei entsprechender Verankerung des Motors über den C-Terminus die kleine, auf das Plus-Ende gerichtete Vorspannung im katalytischen Kern effizient durch die kurze C-terminale Halsmimikregion verstärkt werden, um eine schnelle Beweglichkeit zu erzeugen.

Abgesehen vom prozessiven Kinesin-1-Dimer20, das Mikrotubuli-Protofilamenten folgt, erzeugen die meisten Kinesine, die sich entlang der Mikrotubuli-Längsachse bewegen, auch ein Drehmoment, das in Motilitätstests dazu führt, dass sich gleitende Mikrotubuli um ihre Längsachse drehen. Die daraus resultierende Korkenzieherbewegung der Mikrotubuli wurde in Kinesin-1-, -2-, -3-, -5-, -6-, -8- und -14-Konstrukten beobachtet. Plus-End-gerichtete N-Kinesine verursachen einen linksdrehenden Korkenzieher12,14,15,16,42,49, während minus-End-gerichtete C-Kinesine (Kinesin-14, dimeres Ncd) einen rechtsdrehenden Korkenzieher verursachen18,19 Dies impliziert eine ähnliche Drehmomentrichtung relativ zur katalytischen Domäne in allen Kinesinen (Definition der Händigkeit siehe ergänzende Abbildung 1). Wir untersuchten daher die durch unsere Konstrukte verursachte Mikrotubuli-Rotation in Mikrotubuli-Motilitätstests, die mit einem dreidimensionalen prismatischen optischen Tracking-Mikroskop (tPOT) beobachtet wurden, das 3D-Bewegungen mit nm-Genauigkeit erkennen kann15. In Motilitätstests unter Verwendung von entweder Ncd325-Gel, Kar363-Gel oder KlpA398-Gel Kinesin-14, die über eine C-terminale Gelsolinfusion an der Oberfläche verankert sind und eine Plus-End-gerichtete Motilität aufweisen (Abb. 4a – c und Zusatzfilm). 3), gleitende Mikrotubuli, gedreht mit einem linksdrehenden Korkenzieher mit einer Steigung von ~ 0,3 μm (Abb. 4d – h und ergänzende Abb. 6 und 7). Somit hat sich in Kinesin-14-Konstrukten, bei denen die Längsrichtung von Minus auf Plus umgestellt hat, auch die Mikrotubuli-Rotation von einer rechtshändigen auf eine linkshändige Korkenzieherbewegung umgestellt, was damit übereinstimmt, dass die Drehmomentrichtung relativ zum Kinesinkopf unverändert bleibt. trotz der Längsrichtungsumkehr. Darüber hinaus ähnelt die Steigung des Korkenziehers von ca. 0,3 μm der Steigung, die für die Plus-End-gerichteten Kinesine-1- und -5-Monomere berichtet wird15,25. Dieses Ergebnis steht im Einklang damit, dass die Kinesin-Motordomäne sowohl während der Plus-End- als auch der Minus-End-gerichteten Motilität eine laterale Bewegungskomponente mit der gleichen Größe und Richtung aufweist (ergänzende Abbildung 1). Die Ähnlichkeit der Tonhöhen trotz Geschwindigkeitsunterschieden lässt auf eine enge Verbindung zwischen den Konformationsänderungen schließen, die Längsbewegung und Drehmoment erzeugen. Es deutet auch stark darauf hin, dass der Neck-Linker von N-Kinesinen und der Neck-Mimetikum von C-Kinesinen auf die gleiche Weise funktionieren, um die gleichen Richtungsvektoren von Längs- und Rotationskräften zu erzeugen, mit dem gleichen konstanten Verhältnis der beiden Kräfte in beiden Fällen, was zu der gleichen Korkenziehersteigung führt.

Die 3D-Trajektorien der Korkenzieherbewegung gleitender Mikrotubuli, angetrieben durch C-verknüpftes Ncd. (a) Ein Schema des In-vitro-Korkenziehertests während der 3D-Messung. Der spärlich biotinylierte, Cy5-markierte Mikrotubulus mit einem daran befestigten QD (λ = 525 nm) wird durch C-verknüpftes Ncd325-Gel, das über einen Anti-His-Tag-Antikörper (lila) an der mit Protein G (grau) beschichteten Glasoberfläche verankert ist, wie ein Korkenzieher angetrieben. . (b) Ein Schema des tPOT-Aufbaus (nicht zum Verkauf). Die z-Position eines QD sowie die x-y-Position werden aus einem durch das Prisma geteilten Bildpaar ermittelt. Die Temperatur in der Kammer wird durch die kombinierte Temperaturmanagementeinheit auf 25 °C gehalten. (c) Sequentielle Bilder des an Mikrotubuli befestigten QD, beobachtet unter dem tPOT-Mikroskop. Das untere Bild zeigt einen Cy5-markierten Mikrotubulus, während die anderen einen QD zeigen, der an den translozierenden Mikrotubulus gebunden ist. Die durchgezogenen und offenen Pfeilspitzen zeigen die Bilder an, die durch das Prisma des an die Mikrotubuli gebundenen QD aufgeteilt wurden (Zeit in Sekunden). Maßstabsbalken, 2 μm. (d) Das 3D-Diagramm des QD zeigt die Linksdrehung des gleitenden Mikrotubulus. Der Pfeil gibt die ungefähre Verschiebung während 10 s an. (e) Die in (d) gezeigten x-y- (rot) und x-z-Trajektorien (blau) korkenzieherartiger Mikrotubuli, angetrieben durch Ncd325-Gel. Die Rotationssteigung der durch Ncd325-Gel angetriebenen Korkenzieher-Mikrotubuli wurde durch Anpassen der x-y-Position des QD an eine Sinusfunktion (schwarze Linie) bestimmt, was einen Wert von 0,30 µm ergab. (f) Die y-z-Trajektorie des an den in (d) gezeigten Mikrotubulus gebundenen QD. Die Flugbahn der ersten Umdrehung wird durch die schwarze Linie dargestellt und beginnt am offenen Quadrat. Die Flugbahn zeigt eine Drehung des gleitenden Mikrotubulus gegen den Uhrzeigersinn, wenn man in Richtung der Vorwärtstranslokation blickt. (g) Zeitlicher Verlauf der x-Verschiebung des an den in (d) gezeigten Mikrotubulus gebundenen QD. Die Längsgeschwindigkeit wurde durch Anpassen der x-t-Position des QD an eine lineare Funktion (schwarze Linie) bestimmt, was einen Wert von 0,055 µm s−1 ergab. (h) Zeitlicher Verlauf der Umdrehungen des an das in (d) gezeigten Mikrotubulus gebundenen QD. Die Rotationsgeschwindigkeit wurde durch Anpassen der rev-t-Position des QD an eine lineare Funktion (schwarze Linie) bestimmt, was einen Wert von 0,18 rev s−1 ergab.

Die Determinanten der Kinesin-Motorrichtung auf Mikrotubuli sind von erheblichem Interesse für das Verständnis des molekularen Mechanismus der Kinesin-Motilität. Obwohl frühere Studien die Hals-Helix- und Hals-Mimik-Regionen außerhalb des katalytischen Kerns identifiziert haben, die für die Minus-End-Motilität von Kinesin-14 erforderlich sind, war der Beitrag der N-terminalen Verankerungsanordnung dieser Motoren weniger klar. Endow und Waligora fanden heraus, dass ein dimeres Konstrukt NcdKHC1, bei dem die Motordomäne von Kinesin-1 anstelle der Ncd-Motordomäne ersetzt ist, die N-terminale Halshelix und der Stiel von Ncd zusammen mit der Ncd-Halsnachahmung jedoch erhalten bleiben, ein Minus aufweist -Endgerichtete Motilität, die die normale Plus-End-Motilität des Kinesin-1-Motors umkehrt37. Eine entsprechende monomere N-verknüpfte Chimäre, BP-nKn664, weist ebenfalls eine Minus-End-Direktionalität auf38. Obwohl diese Berichte nahelegten, dass die N-terminale Verankerung wichtig sein könnte, haben neuere Beobachtungen deutlich gemacht, dass die Verankerungsgeometrie von Motoren keine zwingende Voraussetzung für die Minus-End-gerichtete Motilität ist, wie dies nachweislich bei einigen N-terminalen Motor-Kinesin-5 der Fall ist kontextabhängige Minus-End-gerichtete Motilität3,4. Es können jedoch spezifische Faktoren im Zusammenhang mit der Struktur von Kinesin-5 an der Bestimmung seiner Richtung beteiligt sein, da dieselben Faktoren, die eine Richtungsumkehr in mehrköpfigem Kinesin-5 Cin83,4 bewirken, die Richtung in monomeren Knesin-5-Konstrukten von Cut75 oder nicht ändern Cin842. Wir haben daher systematisch getestet, ob die N-terminale Verankerungsgeometrie eine absolute Voraussetzung für die Minus-End-gerichtete Motilität von Kinesin-14-Motoren ist. Um Kopfinteraktionen, ungebundene Kopfausrichtungseffekte oder jegliche Auswirkungen der Stielregion auf die Richtung, wie sie in KlpA50 beobachtet wurden, auszuschließen, verwendeten wir einköpfige Konstrukte (Abb. 1). Durch die Verwendung nativer Monomerkonstrukte, die sich nur in der Geometrie der Verankerung am Substrat unterscheiden, haben wir gezeigt, dass die Längsrichtung der Motilität von Monomer-Kinesin-14 dann durch die N- oder C-terminale Position des Kinesin-Ankers bestimmt wird. Erst wenn der Kinesin-14-Katalysatorkern an seinem N-Terminus durch die N-terminale Halshelix verankert ist, bewegt er sich in Richtung der Minusenden der Mikrotubuli (Abb. 2 und 3). Wir fanden heraus, dass alle drei getesteten Kinesin-14-Katalysatorkerne, einschließlich KlpA, die gleichen Anforderungen an eine N-terminale Bindung hatten, um Motilität am Minusende zu erzeugen. In Bezug auf den Ankergeometrieeffekt wurde festgestellt, dass natives dimeres Kinesin-14 KlpA voller Länge die Fähigkeit besitzt, die Richtung zu ändern9. Wenn die Mikrotubuli-Bindungsstelle im N-terminalen Schwanz von KlpA an denselben Mikrotubuli bindet wie die katalytische Domäne, wechselt sie von der Minus-End- zur Plus-End-Motilität. Unsere Ergebnisse zeigen aufschlussreich, dass eine Änderung der Verankerungsgeometrie auch eine Richtungsumkehr in einem einköpfigen KlpA-Konstrukt bewirken kann, das die KlpA-Halshelix, den katalytischen Kern und das Halsmimetika enthält. Allerdings muss noch geklärt werden, ob die Umkehrmechanismen unseres Konstrukts und die nativen KlpA voller Länge sind verwandt.

Es wurde vorgeschlagen, dass das Hals-Mimetikum von Kinesin-14 die Rolle des Hals-Linkers in anderen Kinesinen bei der Motilität und der Regulierung der ATPase-Aktivität übernimmt33, obwohl sie in ihren Aminosäuresequenzen nur geringe Homologie aufweisen. Zuvor haben wir gezeigt, dass das Halsmimetika die Plus-End-gerichtete Motilität in einem N-terminal verankerten Konstrukt (BP-nKn669) oder die Minus-End-gerichtete Motilität in einem Konstrukt mit 5 Aminosäuren aus dem katalytischen Ncd-Kern (BP-) unterstützt. nKn664)38. Es war jedoch nicht klar, ob das Hals-Mimetika die Plus-End-Motilität in einem C-terminal verankerten Konstrukt unterstützen kann, daher untersuchten wir seine Funktion in C-terminal verankerten nativen Kinesin-14- und chimären Kinesin-1-Konstrukten. Wir fanden heraus, dass sowohl in den nativen Monomer-Kinesin-14-Konstrukten als auch in einem chimären Monomerkonstrukt mit einem katalytischen Kinesin-1-Kern das Kinesin-14-Hals-Mimetikum den Hals-Linker ersetzen und die Plus-End-gerichtete Motilität in diesen C unterstützen könnte -terminal verankerte Konstrukte (Abb. 2). In der C-terminalen Verankerungskonfiguration könnten sowohl der Neck-Linker als auch das Neck-Mimetikum dazu dienen, die Konformationsänderungen im Kinesin zu verstärken und die Mikrotubuli-Motilität zu erhöhen (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 4). Diese Ergebnisse stützen die Ansicht, dass das Neck-Mimetic funktionell dem Neck-Linker entspricht. Wie jedoch in dieser Studie (ergänzende Abbildung 3) und früheren Arbeiten37,38 gezeigt wird, besteht für die Halsmimik und die Halshelix eine Gruppe von 5, um in Hybridkonstrukten, die den Kinesin-1-Motorkern enthalten, eine auf das Minusende gerichtete Motilität zu erzeugen Aminosäuren (AASVN) vom C-terminalen Ende des katalytischen Kinesin-14-Kerns und die N-terminale Verankerung müssen ebenfalls vorhanden sein. Minus-End-gerichtete Motilität in der Chimäre (NcdKHC6), die zusammen mit dem Hals-Linker eine Gruppe von 5 Aminosäuren (GRRAK) vom C-terminalen Ende des Kinesin-1-Katalysatorkerns aufweist, erfordert ebenfalls eine N-terminale Verankerung . Für die gesamte Minus-End-gerichtete Motilität sowohl der Neck-Linker- als auch der Neck-Mimic-Chimären war es erforderlich, dass sowohl die Neck-Helix als auch die N-terminale Verankerung vorhanden waren. In dieser Arbeit zeigen wir, dass die N-terminale Verankerung über eine normale Hals-Helix-Bindung am katalytischen Kern eine absolute Voraussetzung für die Minus-End-gerichtete Motilität einköpfiger Kinesin-Konstrukte ist.

Anders als die auf das Minus-Ende gerichtete Motilität von einköpfigen Kinesinkonstrukten erfordert die auf das Plus-Ende gerichtete Motilität weder eine N- noch eine C-terminale Verankerung, sodass BP-NcdRan14 mit der Hals-Helix an die katalytische Domäne gebunden ist durch Insertion zufälliger Aminosäuren gestört, weist eine Plus-End-gerichtete Motilität auf, selbst wenn es an seinem N-Terminus verankert ist (Abb. 2h und ergänzende Abb. 3). Mit dem Funktionsverlust eines der auf das Minus-Ende gerichteten Motilitätsfaktoren, wie z. B. der ordnungsgemäßen Funktion der Halshelix, wird der Kinesin-14-Motor also auf das Plus-Ende gerichtet. Dies steht im Einklang mit einer früheren Vermutung, dass der konservierte katalytische Kern aller Kinesine möglicherweise eine inhärente Plus-End-Voreingenommenheit aufweist39,51 wobei die Minus-End-Motilität ein Funktionsgewinn ist, der diese inhärente Voreingenommenheit außer Kraft setzt. Wir können jedoch die Möglichkeit nicht ausschließen, dass eine ordnungsgemäße Funktion der Halshelix und der Halsnachahmung von Kinesin-14 für die negativ gerichtete Polarität erforderlich ist, wie mehrere mutierte und chimäre Konstrukte wie BP-NcdRun14 zeigen (Abb. 2 und ). Tabellen 1 und 2) und BP-nKn66938 (ergänzende Abbildung 3) könnte die Verankerung am C-Terminus von Kinesin-14 die korrekte Interaktion von Hals-Helix und Hals-Nachahmung stören und dann über das Plus-Ende gerichtete Polarität induzieren eine Neigung des Halsmimetikums zum Plus-Ende der Mikrotubuli aufgrund sterischer Hinderung. Ein weiterer Beleg dafür, dass zumindest konservierte Konformationsänderungen innerhalb des katalytischen Kerns vorliegen, ergibt sich jedoch aus der konservierten Drehmomentkomponente der Kinesin-Motilität. Frühere Studien haben gezeigt, dass alle getesteten Kinesine trotz unterschiedlicher longitudinaler Motilitätsrichtungen entlang der Mikrotubuli die gleiche Richtungsabweichung des Drehmoments relativ zum Kinesinkopf12,13,14,15,16,17,18 aufweisen, obwohl dies auf die Art und Weise zurückzuführen ist Rotation wird definiert, was etwas verwirrenderweise als „Änderung“ der Rotationsrichtung für Kinesine mit Plus- und Minus-Endrichtung ausgedrückt wird. Unsere Studie hat gezeigt, dass, wenn die Richtung der normalerweise auf das Minus-Ende gerichteten katalytischen Kinesin-14-Kernkonstrukte umgekehrt wird, um durch C-terminale Verankerung auf das Plus-Ende ausgerichtet zu werden, nicht nur diese Drehmomentrichtungsvoreingenommenheit bestehen bleibt, sondern auch die Steigung der Mikrotubuli-Rotation Es bewirkt in Motilitätstests (Abb. 4 und ergänzende Abb. 6 und 7), dass es dem des normalerweise plus-endgerichteten Monomers Kinesin-115,25 ähnelt, was auf eine enge und konservierte Verbindung zwischen den Längs- und Querkomponenten schließen lässt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Verbindung zwischen Drehmoment und Längsmotilität im katalytischen Kern der beiden Kinesin-14- und Kinesin-1-Familien von Kinesinen erhalten bleibt, was auf eine starke Erhaltung der katalytischen Kernfunktion hindeutet.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass eine N-terminale Verankerung für die auf das Minus-Ende gerichtete Motilität in Chimären von Ncd und Kinesin-1 erforderlich ist (ergänzende Abbildung 3) 37, 38. Unsere Beobachtungen zeigen, dass in nativen monomeren Kinesin-14-Konstrukten (Ncd, Kar3 und KlpA) die Halshelix, der katalytische Kinesin-14-Kern und das Hals-Mimetikum nicht ausreichen, um die Minus-End-Motilität zu unterstützen, es sei denn, das Konstrukt ist auch über das Substrat verankert die Halshelix befindet sich am N-Terminus. Wenn die Konstrukte über das C-terminale Hals-Mimetika verankert werden, werden sie zum Plus-Ende gerichtet. Darüber hinaus war die auf das Plus-Ende gerichtete Geschwindigkeit von C-verknüpften Kinesin-14-Konstrukten immer höher als die auf das Minus-Ende gerichtete Geschwindigkeit von N-verknüpften Konstrukten, was darauf hindeutet, dass in der katalytischen Domäne beider Kinesin-1 die gleiche kinetische Tendenz vorliegt und Kinesin-14. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Standardaktivität der hochkonservierten katalytischen Kinesin-Kernmotordomäne in den Kinesin-1- und Kinesin-14-Familien den Mikrotubuli eine zum Plus-Ende gerichtete und linkshändige Korkenzieherrotation verleiht. Darüber hinaus legt die ähnliche Steigung der Korkenzieherbewegung, die von verschiedenen an ihrem C-Terminus verankerten Motoren erzeugt wird, nahe, dass der Mechanismus in den meisten Kinesinen hoch konserviert ist.

Die Monomerkonstrukte Ncd325 verwendeten 325–700 Aminosäuren von Drosophila melanogaster Ncd18, Kar363 verwendeten 363–729 Aminosäuren von Saccharomyces cerevisiae Kar345 und KlpA398 verwendeten 398–770 Aminosäuren von Aspergillus nidulans KlpA9; mit einer N-terminalen oder C-terminalen Avi-Tag-Nukleotidsequenz, die für GLNDIFEAQKIEWHE kodiert, das in Escherichia coli46 biotinyliert ist, wurden sowohl in die Vektoren His-pColdIII (Takara, Shiga, Japan) als auch pET17b (Novagen) kloniert. Monomeres Ncd-Mutantenkonstrukt NcdRan14 mit einer Insertion von 14 zufälligen Resten GESGAKQGEKGESG zwischen 346 und 347 aa, die die Wechselwirkung zwischen Hals-Helix und Motorkern vollständig unterbrechen sollte, wurde entweder in den His-pColdIII-Vektor für C-verknüpftes NcdRan14 oder den pET17b-Vektor für kloniert N-verknüpftes NcdRan14 mit einem C- oder N-terminalen Avi-Tag. Für das monomere chimäre Kinesin nKn664-BP wurde nKn664 (bestehend aus DmNcd K325-N348 – Rattus norvegicus KIF5C I9-K320 – DmNcd A664-K700)38 in den His-pColdIII-Vektor mit einem C-terminalen avi-Tag kloniert. Entweder Ncd325, Kar363 oder KlpA398 wurden in den Gelsolin-His-pColdIII-Vektor42 eingefügt, um C-terminale Gelsolinfusionen zu erzeugen. Alle Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Einzelheiten finden Sie in Abb. 1b und der ergänzenden Abb. 3.

Expressionsplasmide für avi-tag-fusionierte monomere Kinesine, Ncd-Mutanten und Chimären wurden in Zellen des Escherichia coli-Stammes BL21 Star (DE3) (Invitrogen) transformiert. Nach der Expression in BL21 Star (DE3)-Zellen unter Verwendung von entweder 0,1 mM IPTG (Sigma-Aldrich) für 24 Stunden bei 15 °C für His-pColdIII-Vektoren (Takara, Shiga, Japan) oder 0,4 mM IPTG für 6 Stunden bei 23 °C für pET17b-Vektoren (Novagen), Zellen wurden pelletiert und dann in Lysepuffer resuspendiert (pH 7,4: 80 mM PIPES-KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 100 µM ATP, 1 mM DTT, 0,1 % CHAPS, 0,1 % Tween20, 10 % Glycerin, Proteaseinhibitoren und entweder 500 mM NaCl für His-markierte Proteine oder 40 mM NaCl für nicht-his-markierte Proteine) und 20 Minuten lang auf Eis beschallt. Anschließend wurde das Lysat durch Zentrifugation (20 Min., 305.000 g, 2 °C) geklärt. Exprimierte His-markierte Proteine wurden durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie unter Verwendung einer HisTrap HP-Säule (Cytiva) und nicht-His-markierte Proteine durch Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung einer Hitrap SP HP-Säule (Cytiva) gereinigt. Gepoolte Fraktionen wurden unter Verwendung einer HiTrap-Entsalzungssäule (Cytiva) in einen Entsalzungspuffer (80 mM NaCl, 20 mM Kaliumphosphat, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 µM ATP, pH 7,4) ausgetauscht und dann durch Affinitätsbindung an Polymerisate weiter gereinigt Mikrotubuli. Taxolstabilisierte Mikrotubuli wurden mit gereinigten Proteinen, ergänzt mit 1 mM AMPPNP, gemischt und 15 Minuten bei 25 °C inkubiert. Nach der Entfernung der ungebundenen Proteine durch Zentrifugation (20 Min., 305.000 g, 23 °C) wurde das an Mikrotubuli gebundene Kinesin mit ATP-haltigem Puffer (10 mM ATP, 10 mM MgCl2, 200 mM Kaliumacetat, 20–80 µM Taxol) eluiert in M-Puffer [20 mM PIPES-KOH, 4 mM MgCl2, 10 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, pH 7,4]) durch 10-minütige Inkubation bei 25 °C. Mikrotubuli wurden schließlich durch Zentrifugation (20 Min., 305.000 g, 23 °C) entfernt42. Von Bakterien exprimierte, monomere Kinesin-14-Gelsolin-Fusionen wurden mithilfe der Taxol-stabilisierten Mikrotubuli-Affinität wie beschrieben gereinigt52. Gereinigte Kinesine wurden schockgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Konzentrationen von Kinesin-14, Mutanten oder Chimären wurden durch SDS-PAGE auf 10 % Acrylamidgelen unter Verwendung von BSA-Standards (Thermo Fisher Scientific) geschätzt, die auf dasselbe Gel aufgetragen wurden53. Die Gele wurden mit Quick-CBB PLUS (Wako, Osaka, Japan) gefärbt und mit einer CCD-Kamera (CSFX36BC3, Toshiba-teli, Tokio, Japan) abgebildet. Die Banden, die Kinesine und BSA-Standards enthielten, wurden mit ImageJ (NIH) quantifiziert.

Tubulin wurde aus Schweinehirn durch vier Zyklen temperaturregulierter Polymerisation und Depolymerisation in einem PIPES-Puffer mit hoher Molarität gereinigt, um kontaminierende Mikrotubuli-assoziierte Proteine zu entfernen54. Gereinigtes Tubulin wurde schockgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Schweinegehirne wurden von toten Tieren gewonnen und von Shibaura Organ (Tokio, Japan), einem autorisierten Lieferanten von Tierorganen, bereitgestellt.

Cy5-markierte polaritätsmarkierte Mikrotubuli wurden wie beschrieben hergestellt38. Zuerst wurden helle kurze Mikrotubuli (markiertes Tubulin: unmarkiertes Tubulin = 1 : 2) mit 0,5 mM GMPCPP (einem nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon, Jena Bioscience) polymerisiert, dann wurden dünne lange Segmente am Plusende verlängert (markiertes Tubulin: unmarkiertes Tubulin = 1 : 9) wurde durch den Einschluss von NEM-behandeltem Tubulin erreicht, das die Minus-End-Polymerisation hemmt. Mikrotubuli-Gleittests wurden in Flusskammern durchgeführt, die aus KOH-gereinigten Deckgläsern zusammengesetzt waren, die wie beschrieben mit doppelseitigem Klebeband (NW-25, Nichiban, Tokio, Japan oder Scotch W-12, 3M) befestigt waren38. Für Assays mit Avi-Tag-fusionierten Monomer-Kinesinen wurde 1 Flusskammervolumen von 5 mg mL-1 biotinyliertem BSA (Sigma-Aldrich) in die Flusskammer eingeführt, 5 Minuten lang inkubiert und dann mit 4 Volumina M-Puffer gespült. Die Kammeroberfläche wurde nacheinander mit 1 Volumen 5 mg ml-1 Streptavidin (Wako, Osaka, Japan) für 10 Minuten, 4 Volumen 5 mg ml-1 BSA (Sigma-Aldrich) für 3 Minuten und 1 Volumen entweder 0,5 beschichtet –1 µM N- oder C-terminales Avi-Tag-fusioniertes Ncd325, Kar363, KlpA398, NcdRan14 und 1 Volumen von 1 µM C-terminales Avi-Tag-fusioniertes nKn664 für 3 Minuten und dann 4 Volumina von ~ 10 µg mL− 1 Cy5-markierte polaritätsmarkierte Mikrotubuli in BRB80-Puffer [80 mM PIPES-KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8] mit 0,5 mg mL−1 BSA und 20 µM Taxol. Schließlich wurden 4 Volumina Motilitätspuffer (M-Puffer mit 3 mM ATP (Sigma-Aldrich), 20 µM Taxol, ATP-Regenerationssystem, Sauerstofffängersystem, 1 mM DTT, 0,5 mg mL-1 BSA) auf die Kammer aufgetragen. Durch dieses Verfahren wurden monomeres Kinesin-14, die Ncd-Mutante NcdRan14 oder Chimären entweder über ihre C-Termini oder ihre N-Termini an die Glasoberfläche gebunden. Für Rasen aus N-verknüpftem Kinesin-14 oder NcdRan14 wurde die Halshelix über einen Avi-Tag mit dem Deckglas gekoppelt, sodass die N-terminale Halshelix die Gleitkraft ausübt oder überträgt. Im Gegensatz dazu wurde bei Rasenflächen aus C-verknüpften Kinesin-14, NcdRan14 oder Chimären die Anbindung über das C-terminale Hals-Mimetikum erreicht und die N-terminale Hals-Helix wurde getrennt. Alle Kammern wurden mit Nagellack versiegelt. Die Tests wurden bei 24 ± 1 °C durchgeführt. Das Gleiten von Mikrotubuli wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop (Eclipse Ti, Nikon) mit einem stabilen Tisch (KS-N, Chukousya Seisakujo, Tokio, Japan) und einem Tischcontroller (QT-CM2-35, Chuo Precision Ind., Tokio, Japan) beobachtet. , mit Beleuchtung aus einem Quecksilberklumpen (Intensilight, Nikon), 100 × /1,49 NA, Plan-Apochromat-Objektiven (Nikon) und Cy5-Filtersatz (Semrock). Die Bilder wurden mit einer EMCCD-Kamera (iXon X3 DU-897E-COO-#BV, Andor Technology) aufgenommen. Zur Unterdrückung der Positionsdrift, die hauptsächlich durch Temperaturschwankungen verursacht wird, wurde eine Temperaturkontrollausrüstung (F-12, Julabo, Deutschland) eingesetzt. Die Gleitgeschwindigkeit der Mikrotubuli wurde berechnet, indem die zurückgelegte Strecke durch das Zeitintervall (1–40 s) mit der automatisierten Tracking-Software Mark2 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Ken'ya Furuta, NICT) dividiert wurde.55 Es wurden nur gleitende Mikrotubuli analysiert, die eine Länge von > 1 µm hatten und sich nicht kreuzten. Ein fester heller Fleck auf dem Deckglas wurde verfolgt, um die Verschiebung der Mikrotubuli durch Drift vom Gleiten der Mikrotubuli aufgrund langsamer motorischer Aktivität zu unterscheiden. Richtungsabhängigkeit und Geschwindigkeiten wurden anhand von Messungen aus mindestens drei unabhängigen Tests für jedes Konstrukt bestimmt.

Quantenpunkttests (QD) wurden in Durchflusskammern durchgeführt, die aus hydrophoben silanisierten Deckgläsern zusammengesetzt waren, die mit doppelseitigem Klebeband befestigt waren (NW-25, Nichiban, Tokio, Japan). Avi-Tag-fusionierte Kinesine und Streptavidin-beschichtete QDs (Qdot 525 Streptavidin konjugiert, Thermo Fisher Scientific) wurden in einem Molverhältnis von 20:1 in M-Puffer 30 Minuten lang auf Eis gemischt. Für Tests mit immobilisierten polaritätsmarkierten und nicht polaritätsmarkierten Mikrotubuli wurde 1 Durchflusskammervolumen von 40 μg mL-1 Anti-β-Tubulin-Antikörper (Santacruz, SAP. 4G5) in die Durchflusskammer eingeführt, 10 Minuten lang inkubiert und dann gespült mit 4 Volumina M-Puffer. Die Kammeroberfläche wurde nacheinander mit 1 Volumenteil 1 % (Gew./Vol.) Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich) für 10 Minuten, 4 Volumenteilen 5 mg mL−1 Casein für 3 Minuten und 1 Volumenteil ~ 20 μg mL beschichtet -1 Cy5-markierte, polaritätsmarkierte Mikrotubuli, zu denen auch einige nicht polaritätsmarkierte Mikrotubuli gehörten, in BRB80-Puffer mit 0,5 mg mL−1 Casein und 20 µM Taxol. Anschließend wurden nicht immobilisierte Mikrotubuli mit 4 Volumina M-Puffer, der 20 µM Taxol und 0,5 mg mL−1 Casein enthielt, ausgewaschen. Schließlich 50–200 pM QD, beschichtet mit mehreren Kinesinen in Motilitätspuffer (M-Puffer mit 3 mM ATP (Sigma-Aldrich), 20 µM Taxol, ATP-Regenerationssystem, Sauerstofffängersystem, 1 mM DTT und 0,5 mg mL−1 Casein ) wurden auf die Kammer aufgebracht. Die für die Bindung an den QD erforderliche Kinesinkonzentration wurde in einem vorläufigen Screening bestimmt, um Bedingungen zu ermitteln, die es uns ermöglichten, eine stabile Bewegung eines QD entlang des Mikrotubulus zu beobachten. Um dies zu erreichen, musste der QD mit mehreren Motoren ausgestattet sein, die als Team zusammenarbeiten konnten. Da der Durchmesser des QD ~ 25 nm beträgt, kann dieser mehrere daran gebundene Kinesine mit einer Größe von 5–10 nm aufnehmen. Die Kammern wurden mit Nagellack versiegelt. Die Tests wurden bei 24 ± 1 °C durchgeführt. QDs wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Eclipse Ti-PFS, Nikon) mit einem stabilen Tisch (KS-N, Chukousya Seisakujo, Tokio, Japan) und einem Tischcontroller (QT-CM2-35, Chuo Precision Ind., Tokio, Japan) beobachtet. , unter Verwendung der Beleuchtung einer Quecksilberlampe (Intensilight C-HGFIE, Nikon), eines 100×/1,49 NA, Plan-Apochromat-Objektivs (Nikon) und entweder eines Cy5-Filtersatzes für Cy5-markierte Mikrotubuli oder eines Chroma Qdot 525-Sets für QDs. Die Bilder wurden mit einer EMCCD-Kamera (iXon X3 DU-897E-COO-#BV, Andor Technology) aufgenommen. Temperaturkontrollgeräte (F-12, Julabo, Deutschland) wurden verwendet, um Positionsdrift zu unterdrücken, der hauptsächlich durch Temperaturschwankungen verursacht wird38. Wir haben die QDs analysiert, die eine stabile prozessive Bewegung (> 0,25 μm) entlang eines Mikrotubulus zeigten. Diejenigen auf fluktuierenden, gebündelten oder gekreuzten Mikrotubuli wurden ignoriert. QDs, die auf andere QDs trafen, wurden ebenfalls ausgeschlossen. Die individuelle Transportgeschwindigkeit jedes mit mehreren monomeren Kinesinen bedeckten QD wurde berechnet, indem die zurückgelegte Strecke durch das Zeitintervall (0, 3–2 s) mit der automatisierten Tracking-Software Mark255 dividiert wurde. Als sich der QD nicht mehr bewegte, wurde die Analyse an diesem Punkt beendet. Fluoreszenzbilder von QDs wurden mit einer 2D-Gauß-Funktion angepasst, um die Position des Intensitätspeaks der Fluoreszenz zu lokalisieren, der dem Zentrum des QD entspricht. Richtungsabhängigkeit und Geschwindigkeiten wurden anhand von Messungen aus mindestens drei unabhängigen Tests für jedes Konstrukt bestimmt.

Mikrotubuli-Korkenziehertests wurden unter Verwendung von QD-beschichteten Mikrotubuli wie zuvor beschrieben durchgeführt25. Biotinylierte (Biotin-(AC5)2 Sulfo-OSu, Dojindo, Kumamoto, Japan), Cy5-markierte (Cy5 Mono NHS Ester, Cytiva) Mikrotubuli wurden durch Copolymerisation von biotinyliertem, Cy5-markiertem und nicht fluoreszierendem Tubulin in einem Molar hergestellt Verhältnis von 1:3:75 in BRB80 mit 1 mM GTP und 1 mM MgCl2 für 30 Minuten bei 37 °C und dann stabilisiert durch 20 μM Taxol. QD-beschichtete Mikrotubuli wurden durch Zugabe von 13 nM Streptavidin-beschichtetem QD (Qdot 525 Streptavidin-Konjugat, Thermo Fisher Scientific), verdünnt in BRB80 mit 20 µM Taxol (BRB80T), hergestellt und 30 Minuten lang mit einem gleichen Volumen von 4 mg mL−1 Mikrotubuli inkubiert und dann auf 33 pM QD und 10 μg mL-1 Mikrotubuli in BRB80T verdünnt, das 0,4 mg mL-1 α-Kasein (Sigma-Aldrich) enthält. Mikrotubuli-Korkenziehertests wurden in Durchflusskammern durchgeführt, die aus KOH-gereinigten Deckgläsern zusammengesetzt waren, die wie beschrieben mit doppelseitigem Klebeband (NW-25, Nichiban, Tokio, Japan) befestigt waren. Für Assays mit His-Tag und Gelsolin-fusionierten Monomer-Kinesinen wurde 1 Durchflusskammervolumen von 5 mg mL-1 Protein G (Sigma-Aldrich) in die Durchflusskammer eingeführt, 5 Minuten lang inkubiert und dann mit 4 Volumina M-Puffer gespült . Die Kammeroberfläche wurde nacheinander 10 Minuten lang mit 1 Volumenteil 50 μg mL-1 Anti-His-Tag-Antikörper (Qiagen), 3 Minuten lang mit 4 Volumenteilen 0,4 mg mL-1 α-Kasein und 3 Minuten lang mit 1 Volumenteil 1 µM C beschichtet -terminales His-tag-fusioniertes Ncd325-Gel, Kar363-Gel oder KlpA398-Gel für 5 Minuten und dann 4 Volumina von ~ 10 µg mL−1 Cy5-markierten QD-beschichteten Mikrotubuli in BRB80 mit 0,4 mg mL−1 α-Casein und 20 µM Taxol. Schließlich wurden 4 Volumina Motilitätspuffer (M-Puffer mit 3 mM ATP (Sigma-Aldrich), 20 µM Taxol, ATP-Regenerationssystem, Sauerstofffängersystem, 1 mM DTT und 0,4 mg mL-1 α-Kasein) aufgetragen die Kammer. Alle Kammern wurden mit Nagellack versiegelt. Die Tests wurden bei 25 °C durchgeführt. Zur Unterdrückung der Positionsdrift, die hauptsächlich durch Temperaturschwankungen verursacht wird, wurde eine Temperaturkontrollausrüstung (F-12, Julabo, Deutschland) eingesetzt. Das Prinzip des 3D-Trackings wurde bereits beschrieben15. Die Fluoreszenz wurde durch einen geeigneten Filtersatz geleitet (Cy5-Filtersatz, Semrock, für Cy5-markierte Mikrotubuli und Qdot 525-Satz, Chroma, für Quantenpunkte 525 nm). Eine achromatische Linse 1 wurde außerhalb des Kameraanschlusses des Mikroskops platziert, um eine äquivalente hintere Brennebene zu erzeugen, in der ein speziell angefertigtes Keilprisma (86,5°), das mit einer Antireflexionsschicht beschichtet war, präzise eingestellt wurde. Zwei geteilte Bilder der Probe wurden auf der Kamera mit einer anderen achromatischen Linse-2 mit einem gewünschten f fokussiert, was die Vergrößerung des optischen Systems bestimmte. Zur Kalibrierung der Z-Achsen-Position, in der das Objektiv mit konstanter Geschwindigkeit verschoben wurde, war der stabile Tisch mit einem Schrittmotor (SGSP-13ACT, SIGMAKOKI, Tokio, Japan) und einer Steuerung (SHOT-204MS, SIGMAKOKI, Tokio) ausgestattet , Japan). QDs wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Eclipse Ti-PFS, Nikon) mit einem stabilen Tisch (KS-N, Chukousya Seisakujo, Tokio, Japan) und einem Tischcontroller (QT-CM2-35, Chuo Precision Ind., Tokio, Japan) beobachtet. , unter Verwendung einer Quecksilberlampe (Intensilight C-HGFIE, Nikon), einer 100×/1,49 NA, Plan-Apochromat-Objektivlinse (Nikon) und entweder einem Cy5-Filterset für Cy5-markierte Mikrotubuli oder einem Chroma Qdot 525-Set für QDs. Die Bilder wurden in Abständen von 0,5–1 s mit einer EMCCD-Kamera (iXon X3 DU-897E-COO-#BV, Andor Technology) aufgezeichnet. Die QD-Bewegung wurde mit Igor Pro 5.05A15 verfolgt und quantifiziert. Händigkeit und Tonhöhe wurden anhand von Messungen aus mindestens drei unabhängigen Tests für jedes Konstrukt bestimmt.

Tracking-Daten für Mikrotubuli und QDs wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten erhalten, und die Probengrößen sind im Text oder im Abschnitt „Methode“ ausführlich angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle in dieser Studie verwendeten Plasmide sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Quelldaten dieser Studie, die zur Erstellung der Grafiken und Tabellen verwendet wurden, werden als Ergänzungsdaten 1 bereitgestellt.

Für die Verfolgung von QDs, die an gleitende Mikrotubuli gebunden sind, wurden mit Igor Pro 5.05A benutzerdefinierte Skripte geschrieben. Die Skripte sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken M. Sugawa für die technische Unterstützung und K. Furuta für die Tracking-Software Mark2. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Fördernummer JP16KT0065, JP20K06635, JP21K19252 an JY und JP20K15744 für MY) und von MEXT KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Fördernummer JP21H00386, JP21H05868 für JY) unterstützt.

Abteilung für Biowissenschaften, Graduate School of Arts and Sciences, Universität Tokio, 3-8-1 Komaba, Meguro-ku, Tokio, 153-8902, Japan

Masahiko Yamagishi, Rieko Sumiyoshi und Junichiro Yajima

Zentrum zur Förderung internationaler Bildung und Forschung, Fakultät für Landwirtschaft, Kyushu-Universität, 744 Motooka, Nishi-ku, Fukuoka, 819-0395, Japan

Douglas R. Drummond

School of Interdisciplinary Science and Innovation, Kyushu University, 744 Motooka, Nishi-ku, Fukuoka, 819-0395, Japan

Douglas R. Drummond

Komaba Institute for Science, Universität Tokio, 3-8-1 Komaba, Meguro-ku, Tokio, 153-8902, Japan

Junichiro Yajima

Forschungszentrum für komplexe Systembiologie, Universität Tokio, 3-8-1 Komaba, Meguro-ku, Tokio, 153-8902, Japan

Junichiro Yajima

Universal Biological Institute, Universität Tokio, Bunkyo-ku, Tokio, 113-0033, Japan

Junichiro Yajima

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JY hat das Projekt entworfen. MY konstruierte die Proteine und führte einen Motilitätstest durch. MY und RS reinigten die Proteine. JY, MY und DD interpretierten die Daten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Junichiro Yajima.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Yamagishi, M., Sumiyoshi, R., Drummond, DR et al. Die Verankerungsgeometrie ist ein wesentlicher Faktor bei der Bestimmung der Richtung der Kinesin-14-Motilität auf Mikrotubuli. Sci Rep 12, 15417 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19589-4

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Eingegangen: 03. Juni 2022

Angenommen: 31. August 2022

Veröffentlicht: 14. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19589-4

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