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Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7962 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die d,d-Transpeptidase-Aktivität von Penicillin-bindenden Proteinen (PBPs) ist das bekannte Hauptziel von β-Lactam-Antibiotika, die die Peptidoglycan-Polymerisation blockieren. Die durch β-Lactam induzierte Abtötung von Bakterien beinhaltet komplexe nachgeschaltete Reaktionen, deren Ursachen und Folgen schwer zu klären sind. Hier nutzen wir den funktionellen Ersatz von PBPs durch eine β-Lactam-unempfindliche l,d-Transpeptidase, um Gene zu identifizieren, die für die Abschwächung der Auswirkungen der PBP-Inaktivierung durch β-Lactame in sich aktiv teilenden Bakterien wesentlich sind. Die Funktionen der 179 bedingt essentiellen Gene, die durch diesen Ansatz identifiziert wurden, gehen weit über L,D-Transpeptidase-Partner für die Peptidoglycan-Polymerisation hinaus und umfassen Proteine, die an der Stressreaktion und am Aufbau von Polymeren der äußeren Membran beteiligt sind. Zu den unerwarteten Wirkungen von β-Lactamen gehören der Verlust der Lipoprotein-vermittelten kovalenten Bindung, die die äußere Membran mit dem Peptidoglycan verbindet, eine Destabilisierung der Zellhülle trotz effektiver Peptidoglycan-Vernetzung und eine erhöhte Permeabilität der äußeren Membran. Der letztgenannte Effekt weist darauf hin, dass die Wirkungsweise von β-Lactamen auf einer selbstvermittelten Penetration durch die äußere Membran beruht.

Gramnegative Bakterien wie Escherichia coli besitzen eine mehrschichtige Hülle, die den Turgordruck des Zytoplasmas (Zellwand-Peptidoglycan) aufrechterhält und als selektive chemische Barriere für Nährstoffe, Abfallstoffe und toxische Verbindungen (innere und äußere Membranen) fungiert (Abb . 1a)1. Mehrere Polymere, die Protein-, Peptid-, Glykan- und Lipideinheiten enthalten, gewährleisten die mechanischen Eigenschaften und die Transportfunktionen der Hülle. Das Peptidoglycan (PG), das über das Braun-Lipoprotein kovalent an die äußere Membran gebunden ist, ist ein riesiges netzartiges Makromolekül (ca. 109 Da), das aus einer Disaccharid-Pentapeptid-Einheit polymerisiert ist (Abb. 1b). Glykosyltransferasen katalysieren die Bildung von β-1,4-glykosidischen Bindungen zwischen Disacchariden, um Glykanketten zu bilden, die anschließend durch Transpeptidasen miteinander vernetzt werden (Abb. 1c). Letztere Enzyme, die d,d-Transpeptidasen, werden auch als Penicillin-bindende Proteine ​​(PBPs) bezeichnet, da sie die wesentlichen Angriffspunkte von β-Lactam-Antibiotika sind. Bei der Peptidoglycan-Polymerisation interagieren PBPs mit dem d-Ala4-d-Ala5-Ende eines Pentapeptidstamms (daher die d,d-Bezeichnung) und bilden eine kovalente Bindung zwischen d-Ala4 und ihrem Ser-Rest im aktiven Zentrum unter gleichzeitiger Freisetzung von d -Ala5. Im folgenden Schritt reagiert das resultierende Acylenzym mit dem zweiten Substrat, meist einem Tetrapeptidstamm, unter Bildung eines 4 → 3 vernetzten Tetra-Tetra-Dimers unter gleichzeitiger Freisetzung des PBP (Abb. 1c; ergänzende Abb. S1a)2. In Zusammenarbeit mit Gerüstproteinen und Endopeptidasen vermitteln die d,d-Transpeptidasen die Insertion von Glykansträngen in das expandierende PG-netzartige Makromolekül, bestimmen dadurch die Bakterienform und gewährleisten eine mechanische Barriere gegen den osmotischen Druck des Zytoplasmas während der gesamten Zelle Zyklus3,4,5,6,7.

a Die Hülle besteht aus inneren (IM, grau) und äußeren (OM, schwarz) Membranen. Peptidoglycan (PG, blau) sorgt für den osmotischen Schutz der Bakterienzelle. Das IM ist eine Lipiddoppelschicht, die hauptsächlich aus Phospholipiden (PL) besteht. Das OM ist eine asymmetrische Lipiddoppelschicht: Das innere Blättchen besteht aus PL und das äußere Blättchen aus Lipopolysacchariden (LPS) und Phosphatidylglyceriden, die durch das gemeinsame Enterobakterien-Antigen (ECAPGL) ersetzt sind. b Struktur der PG-Untereinheit (GlcNAc, N-Acetylglucosamin; MurNAc, N-Acetylmuraminsäure). c PG ist ein netzartiges Makromolekül aus Glykanketten (blauviolette Polygone), die durch kurze Peptidstämme (farbige Kreise) miteinander vernetzt sind. PBPs katalysieren die Bildung von 4 → 3 Querverbindungen, die die 4. Position eines Acyldonorstamms mit der 3. Position des Akzeptors verbinden. Zwei Mitglieder der LDT-Familie (YcbB und YnhG) katalysieren die Bildung von 3 → 3-Vernetzungen. Drei LDTs ​​(ErfK, YbiS und YcfS) verankern das Braun-Lipoprotein (Lpp) am PG. Durch die Verknüpfung von DAP an der dritten Position eines PG-Spenderstamms mit dem Arg-Lys-Ende des Lpp entsteht eine kovalente Verbindung zwischen dem OM und dem PG. Die PG-Lpp-Verbindung wird durch das YafK LDT46,47 hydrolysiert. d rpHPLC-Profil von Muropeptiden aus Stamm BW25113(ycbB, relA'), gezüchtet ohne Ceftriaxon. Die Struktur wird aus den Fragmenten abgeleitet, die durch Verdauung von PG mit Muramidasen erhalten wurden, die die MurNAc-GlcNAc-β-1,4-Bindung spalten. e Struktur der Muropeptide abgeleitet aus massenspektrometrischen Analysen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Umgehung der d,d-Transpeptidase-Aktivität von PBPs durch strukturell nicht verwandte l,d-Transpeptidasen (LDTs) führt zu einer Resistenz gegen die meisten β-Lactame8,9. Die l,d-Transpeptidasen spalten die l,d-mesoDAP3-d-Ala4-Peptidbindung von Tetrapeptidstämmen und bilden 3 → 3 Querverbindungen (Abb. 1c; ergänzende Abb. S1b)10. Andere Mitglieder der l,d-Transpeptidase-Familie sind für die Verankerung des Braun-Lipoproteins am PG verantwortlich (ergänzende Abbildung S1c)11. Die Aktivierung des meist kryptischen L,D-Transpeptidase-PG-Polymerisationswegs wurde erstmals in in vitro selektierten β-Lactam-resistenten Mutanten von Enterococcus faecium entdeckt12,13. l,d-Transpeptidierung ist der Hauptmodus der PG-Vernetzung beim pathogenen Mycobacterium tuberculosis14 und kann durch Drittlinien-Chemotherapien auf Basis des β-Lactams Meropenem angegriffen werden15. In E. coli erfordert die Aktivierung des Signalwegs eine Überproduktion sowohl der YcbB-l,d-Transpeptidase (LdtD) als auch des Guanosinpenta- oder -tetraphosphats (p)ppGpp-Alarmons8. Anschließend wurde berichtet, dass YcbB an der PG-Erhaltung beteiligt ist, da es Defekte beim Lipopolysaccharid-Export ausgleicht16.

Die d,d-Transpeptidase-Aktivität von PBPs wurde in den 1960er Jahren als primäres Ziel von β-Lactamen identifiziert17. Dennoch stellt die Entschlüsselung der nachgelagerten Ereigniskaskade, die zum bakteriellen Tod führt, besondere Herausforderungen dar18,19,20,21. Dieses Thema ist nach wie vor Gegenstand intensiver Untersuchungen.

In dieser Arbeit untersuchen wir die Funktionen, die für die Rettung der β-Lactam-inaktivierten 4 → 3-Vernetzungsaktivität von PBPs durch die 3 → 3-Vernetzungsaktivität der l,d-Transpeptidase YcbB auf Genomebene wesentlich sind . Die Ergebnisse basieren auf der Tn-seq-Identifizierung von Genen, die für die YcbB-vermittelte β-Lactam-Resistenz wesentlich sind, der Konstruktion mehrerer Gendeletionen zur Entschlüsselung epistatischer Beziehungen und der Bestimmung der Struktur von PG durch Massenspektrometrie (Abb. 1d, e). Diese Analyse öffnet ein neues Fenster zur Entwicklungsfähigkeit der Zellhülle, zum komplexen Netzwerk von Wechselwirkungen, die mit der Homöostase der Hüllenpolymere zusammenhängen, und zu den Mechanismen, die E. coli entwickelt, um den durch β-Lactam-vermittelten Stress zu bekämpfen d,d-Transpeptidase-Inaktivierung.

Ein Transposon-Sequenzierungsansatz (Tn-seq)22 wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die für die YcbB-vermittelte β-Lactam-Resistenz im Genom von E. coli BW25113(ycbB, relA')8 essentiell sind. Dieser Stamm kombiniert eine hohe Produktion der l,d-Transpeptidase YcbB und der (p)ppGpp-Synthetase RelA' nach Induktion der ycbB- bzw. relA'-Gene durch IPTG und l-Arabinose. Zwei Versuchsbedingungen, Abwesenheit (−CRO) oder Anwesenheit (+CRO) von Ceftriaxon, wurden verglichen. Für unsere Analyse wurde das β-Lactam Ceftriaxon ausgewählt, da dieses Breitspektrum-Cephalosporin der 3. Generation bei der Inaktivierung aller zur PBP-Familie gehörenden d,d-Transpeptidasen hochwirksam ist und spezifisch für diese Enzyme ist, da l,d-Transpeptidasen aufgrund von nicht inaktiviert werden eine Kombination aus ineffektiver Acylierung und Bildung eines Acylenzyms, das zur Hydrolyse neigt23,24. Für beide Bedingungen wurden IPTG und L-Arabinose hinzugefügt, um Gene zu induzieren, die für die YcbB-L,D-Transpeptidase bzw. die RelA' (p)ppGpp-Synthase kodieren. Die genomische DNA-Extraktion wurde an Pools von 810.000 (−CRO) und 260.000 (+CRO) Transformanten durchgeführt und sequenziert. Technische Duplikate unabhängiger DNA-Extraktionen ergaben R2-Korrelationskoeffizienten von 0,90 und 0,94 für die −CRO- bzw. +CRO-Bedingungen (Abb. 2a, b). Kreuzungshaltige Sequenzen wurden mit dem Referenzgenom von E. coli BW25113 abgeglichen und essentielle Gene durch Quantifizierung des Vorhandenseins von Lücken in den Insertionen identifiziert (Abb. 2c). Die durchschnittliche Anzahl der Lesevorgänge pro Gen wurde verglichen, um Gene zu identifizieren, in denen Transposon-Insertionen im +CRO-Zustand signifikant (p-Wert <0, 05) unterrepräsentiert waren (Abb. 2d; ergänzende Datendatei 1a).

a, b Korrelation der normalisierten durchschnittlichen Lesezahlen pro CDS für zwei sequenzierte technische Replikate, die für die Bedingungen −CRO bzw. +CRO erhalten wurden. c Häufigkeit und Ort der Transposon-Insertionen. Ringe, vom äußersten zum innersten, entsprechen: (i) den BW25113-Koordinaten; (ii) die Sense- (hellgrau) und Antisense-CDS (grau); (iii) der Log2 der fachen Änderung der Einfügung für die Bedingungen −CRO gegenüber +CRO. Daten für Verhältnisse von −CRO zu +CRO kleiner und größer als 1 werden in Gelb bzw. Lila angezeigt; und (iv) die Sense- und Antisense-CDS, die im +CRO-Zustand besonders wichtig sind. d Das Vulkandiagramm stellt Gene dar, für die die Transposon-Inaktivierung im +CRO-Zustand vorteilhaft oder schädlich ist. Die X-Achse stellt den Log2 der fachen Änderung der durchschnittlichen Lesevorgänge pro Gen für die Bedingungen −CRO gegenüber +CRO dar. Die Y-Achse stellt den negativen log10 des p-Werts dar, der aus dem ungepaarten zweiseitigen t-Test erhalten wurde. Der rosa Bereich entspricht Genen mit einer mindestens 4-fach geringeren Anzahl an Insertionen im +CRO-Zustand mit einem p-Wert < 0,05. e Biologische Funktionen von Genen, die bei der +CRO-Erkrankung besonders wichtig sind. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Tn-seq-Analysen ergaben, dass von den 4309 annotierten CDSs 179 im +CRO-Zustand gemäß einer strengen Kombination von drei Kriterien selektiv essentiell waren, darunter (i) das Vorhandensein einer Lücke in den Transposon-Insertionen, (ii) ein signifikanter p- Wert (< 0,05) und (iii) eine Faltungsänderung größer als 4 (siehe „Methoden“) (Ergänzungsdatendatei 1b). Es wurde festgestellt, dass im −CRO-Zustand keine Gene selektiv essentiell sind. Die 179 selektiv essentiellen +CRO-Gene wurden sieben Funktionskategorien zugeordnet, wobei sich herausstellte, dass die Mehrheit am Metabolismus von Hüllkomponenten (N = 71, 40 %) und an Stressreaktionen (N = 35, 20 %) beteiligt ist (Abb. 2e). ). Relevante Tn-seq-Profile der in dieser Studie diskutierten Gene wurden in der Ergänzungsdatendatei 2 zusammengestellt.

Die Synthese des Septums wird durch Komponenten des Divisoms vermittelt, die in der Zellmitte durch den Aufbau des FtsZ-Rings rekrutiert werden (Abb. 3a)6. Die Proteine ​​des Kerndivisoms, FtsA, FtsEX, FtsQLB, FtsW, FtsZ, ZipA und PBP3, waren jeweils sowohl unter −CRO- als auch unter +CRO-Bedingungen essentiell. Im Gegensatz dazu sind Divisome-assoziierte Proteine ​​an der Kontrolle des Zellzyklus (MinCD, FtsK)25,26, an der Stabilisierung des Divisomes unter Stressbedingungen (FtsP)27,28,29 und an der Bereitstellung einer physikalischen Verbindung mit beteiligt äußere Membran (TolABQR und Pal)30 waren nur im +CRO-Zustand essentiell (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2).

a, b Schematische Darstellung des Divisoms bzw. Elongasoms. c Tn-seq-Insertionsprofile von Genen, die Komponenten des Elongasoms kodieren. Leserahmen sind am unteren Rand des Panels angegeben und farblich gekennzeichnet: Rot, Gene, die für +CRO selektiv essentiell sind; grün, Gene, die sowohl für −CRO als auch für +CRO essentiell sind; grau, Gene sind in beiden Fällen nicht essentiell. Transposon-Insertionsstellen werden durch Linien über den Leserahmen angezeigt, deren Höhe die Anzahl der Lesevorgänge für jede Insertion widerspiegelt. d Wesentlichkeit der Gene, die die Elongasomkomponenten PBP2 und RodA kodieren, getestet durch ortsspezifische Mutagenese. Die Ausplattierungseffizienz wurde in Gegenwart von Ceftriaxon in einer Konzentration von 8 µg/ml (+Ceftriaxon) oder ohne Arzneimittel (−Ceftriaxon) auf BHI-Agarplatten, ergänzt mit 40 µM IPTG und 1 % l-Arabinose zur Induktion von ycbB bzw. relA', getestet. Die Platten wurden bei 28 °C inkubiert, da die Stämme, die mrdA S330A und mrdA S330C enthielten, in Gegenwart von Ceftriaxon bei 37 °C nicht wuchsen.

Die Ausdehnung der Seitenwand von Peptidoglycan wird durch das Elongasom vermittelt (Abb. 3b), zu dem (i) RodA, eine Glycosyltransferase aus der SEDS-Proteinfamilie (Shape, Elongation, Division, and Sporulation), (ii) PBP2, ein katalytisch monofunktionelles Klasse-B-PBP mit d,d-Transpeptidase-Aktivität und (iii) MreB, ein Aktin-ähnliches Protein, das ein Gerüst-Zytoskelett für den Elongasom-Komplex bildet6.

Frühere Analysen ergaben, dass das Elongasom für das Wachstum von Mutanten, die das (p)ppGpp-Alarmon überproduzieren, entbehrlich ist31,32. Wie erwartet zeigte die Tn-seq-Analyse, dass jedes der sechs Elongasom-Gene (mrdA, rodA, rodZ, mreB, mreC und mreD) für das Wachstum im −CRO-Zustand entbehrlich war, zu dem auch L-Arabinose für die Produktion von (p) gehörte. ppGpp durch RelA' (Abb. 3c). Das Wachstum der Elongasom-Mutanten hing außerdem von der Expression des relA' (p)ppGpp-Synthase-Gens ab (ergänzende Abbildung S2a). Bemerkenswerterweise waren die sechs Elongasom-Gene im +CRO-Zustand trotz (p)ppGpp-Produktion jeweils essentiell (Abb. 3c). Die Essentialität von PBP2 (kodiert durch mrdA) war unerwartet, da dieses PBP aufgrund der Inaktivierung seiner d,d-Transpeptidase-Domäne durch Ceftriaxon nicht direkt an der PG-Vernetzung teilnehmen konnte8,33. Die Komponenten des Elongasoms werden von kompakten Genclustern kodiert, die sehr empfindlich auf polare Effekte reagieren, die möglicherweise die Transkriptionsniveaus benachbarter Gene verändern. Wir haben daher unsere Tn-seq-Ergebnisse durch einen CRISPR-Cas9-Ansatz (ergänzende Abbildung S2b) zur einstufigen ortsgerichteten Mutagenese von mrdA ergänzt, um die Transpeptidaseaktivität von PBP2 zu beeinträchtigen. Der Ausdruck einer Ceftriaxon-Resistenz wurde durch die Deletion von mrdA aufgehoben, jedoch nicht durch den Ersatz des katalytischen Ser-Rests der d,d-Transpeptidase durch Ala oder Cys (Abb. 3d; ergänzende Abb. S2c). Daher war PBP2, nicht jedoch seine Transpeptidaseaktivität, für die Arzneimittelresistenz essentiell.

Ein ähnlicher CRISPR-Cas9-Ansatz, der auf die Mutagenese des Glykosyltransferase-Gens rodA angewendet wurde, ergab, dass eine katalytisch aktive Form der Glykosyltransferase für das Wachstum in Gegenwart von Ceftriaxon erforderlich war (Abb. 3d; ergänzende Abb. S2c). Es wurde zuvor gezeigt, dass PBP2, RodZ, MreB, MreC und MreD jeweils essentiell für den Aufbau des Elongasoms sind und dass die Wechselwirkung zwischen PBP2 und RodA nicht von der PBP2-Aktivität abhängt34,35,36. Daher erforderte die PG-Vernetzung durch YcbB die Polymerisation von Glykanketten durch RodA in einem funktionellen Elongasom, das sowohl RodA als auch PBP2 enthielt, wobei die Transpeptidaseaktivität des letzteren Enzyms entbehrlich war.

In E. coli werden 40–50 % des PG pro Generation abgebaut, wobei > 90 % der resultierenden Muropeptide von der Zelle recycelt werden37,38. Dies beinhaltet den retrograden Transport von PG-Fragmenten in das Zytoplasma durch spezialisierte Permeasen, AmpG und den Opp-Komplex, gefolgt von der Wiederverwertung der Zucker- und Peptideinheiten als Glucosamin bzw. Tripeptid l-Ala-γ-d-Glu-DAP (Abb . 4a). Die Tn-seq-Analyse zeigte, dass Gene, die für die AmpG-Permease und jede Komponente des Opp-Komplexes kodieren, sowohl unter −CRO- als auch unter +CRO-Bedingungen für das Wachstum vollständig entbehrlich waren. Wir haben außerdem gezeigt, dass ein PG-Recycling vollständig entbehrlich ist, indem wir eine ΔampG ΔoppF ΔmppA-Dreifachmutante konstruiert haben, die sich trotz des Verlusts beider Transporter als lebensfähig und resistent gegen Ceftriaxon erwies (ergänzende Abbildung S3a). Dennoch war die zytoplasmatische l,d-Carboxypeptidase LdcA im +CRO-Zustand essentiell, jedoch nicht im −CRO-Zustand (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). Es wurde zuvor gezeigt, dass dieses Enzym d-Ala4 aus recycelten Tetrapeptidstämmen schneidet, um das l-Ala-γ-d-Glu-DAP-Tripeptid bereitzustellen, das von der Mpl-Ligase direkt an UDP-MurNAc hinzugefügt wird39,40. Es wurde berichtet, dass eine Störung des für LdcA kodierenden Gens während des stationären Wachstums zu einer Bakteriolyse führt, was auf eine drastisch verringerte Vernetzung zurückzuführen ist, da recycelte Tetrapeptidstämme nicht als Acyldonoren für d,d-Transpeptidasen dienen können (ergänzende Abbildung S1)40. Dieselbe Erklärung kann die wesentliche Rolle von LdcA bei der Ceftriaxon-Resistenz nicht erklären, da YcbB Tetrapeptidstämme als Acyldonoren verwendet8. Nichtsdestotrotz beruhte die wesentliche Rolle von LdcA im +CRO-Zustand auf der Eliminierung importierter Tetrapeptide, da die Deletion des mpl-Gens das Wachstum der ΔldcA-Mutante in Gegenwart von Ceftriaxon wiederherstellte (ergänzende Abbildung S3a). Die Überexpression von murA, das für das Enzym kodiert, das den ersten festgelegten Schritt der PG-Synthese katalysiert (Abb. 4a), stellte auch die Resistenz des ΔldcA-Mutanten wieder her (ergänzende Abb. S3b). Somit kompensiert die Steigerung des Stoffwechselflusses über den PG-Assemblierungsweg die Toxizität der importierten Tetrapeptide. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Mpl das Tetrapeptid an UDP-MurNAc ligiert und dass in Abwesenheit von LdcA die resultierenden Tetrapeptid-haltigen Vorläufer in nachfolgenden PG-Syntheseschritten ineffektiv verwendet werden und die globale Wirksamkeit des Weges beeinträchtigen.

a Die PG-Untereinheit wird sowohl durch De-novo-Synthese (links) als auch durch Recycling von PG-Fragmenten (rechts) zusammengesetzt. b Synthese von Colansäure-Nukleotidzuckervorläufern. c Zusammenbau der Colansäure-Untereinheit, verknüpft mit dem Undecaprenyl-Lipid-Träger. d Polymerisation und Transport von Colansäure zur Zelloberfläche. Abkürzungen: Ac-Acetyl; C55-Undecaprenyl-Lipid-Träger; IM innere Membran; OM-Außenmembran; P-Phosphat; Pyr-Pyruvat.

Es wurde berichtet, dass DapF, das l,l-DAP in mesoDAP umwandelt, für das Wachstum in E. coli entbehrlich ist41. MurE-Ligase katalysiert die Addition von l,l-DAP an UDP-MurNAc-l-Ala-d-Glu, wenn auch aufgrund eines 3000-fachen Unterschieds in Km41 weniger effektiv als die Addition von mesoDAP. Die Löschung des für DapF kodierenden Gens führt zum Einbau von l,l-DAP in Peptidoglycan-Vorläufer. l,l-DAP-haltige Stammpeptide wurden von den PBPs wirkungslos als Acyldonoren, jedoch nicht als Akzeptor verwendet41. Die Gesamtvernetzung von Peptidoglycan war mäßig verringert41. Dementsprechend wurde l,l-DAP durch gereinigtes PBP1b in vitro stark von mesoDAP unterschieden42. In unserer Studie war dapF im −CRO-Zustand nicht essentiell. Im Gegenteil wurden in diesem Gen im +CRO-Zustand keine Transposon-Insertionen gefunden (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). Die Bildung von 3 → 3 vernetzten Dimeren wurde in einer ΔdapF-Mutante nachgewiesen (ergänzende Abbildung S4), die massenspektrometrische Analyse ermöglichte jedoch keine Unterscheidung zwischen den beiden DAP-Stereoisomeren. Unsere Peptidoglycan-Analyse zeigte außerdem, dass die Deletion von dapF die Verankerung des Braun-Lipoproteins am PG nicht verhinderte (ergänzende Abbildung S4). Somit tolerierten l,d-Transpeptidasen, ähnlich wie PBPs, bis zu einem gewissen Grad den Einbau von l,l-DAP in Peptidoglycan-Vorläufer nach Deletion von dapF. Die Essentialität von dapF im +CRO-Zustand könnte durch eine verringerte Wirksamkeit des PG-Assemblierungswegs erklärt werden, wie oben für die ldcA-Nullmutante beobachtet.

Mit Ausnahme von dapF wurden alle Gene, die für Enzyme kodieren, die an PG-Biosyntheseschritten beteiligt sind, von denen bekannt ist, dass sie von einem einzelnen Enzym durchgeführt werden, sowohl unter +CRO- als auch unter −CRO-Bedingungen als essentiell identifiziert (Abb. 4a). Daten zu wesentlichen Biosyntheseschritten mit redundanten Enzymfunktionen sind in der ergänzenden Abbildung S5 aufgeführt.

Das äußerste Polymer der Zellwand der meisten E. coli-Stämme ist eine Kapsel aus Colansäure43. WcaJ katalysiert den ersten bestimmten Schritt beim Aufbau des Colansäure-Vorläufers. Das für WcaJ kodierende Gen war unter den Bedingungen −CRO und +CRO nicht essentiell, was darauf hinweist, dass das Fehlen der Kapsel sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von Ceftriaxon mit dem Wachstum vereinbar war (Abb. 4b – d). Unerwarteterweise waren alle anderen Enzyme im Colansäure-Syntheseweg unter +CRO-Bedingungen essentiell, jedoch nicht unter −CRO-Bedingungen (Ergänzungsdatendatei 1b; Ergänzungsdatendatei 2). Angesichts der Tatsache, dass der Verlust aller anderen Colansäure-Biosyntheseenzyme voraussichtlich zu einer Akkumulation von Undecaprenyl-gebundenen Vorläufern führen wird, kamen wir zu dem Schluss, dass diese Enzyme für die Verhinderung der Sequestrierung des Lipidträgers unerlässlich sind. Nach diesem Modell würde die Sequestrierung von C55 indirekt die Bildung anderer Polymere, wie etwa des essentiellen PG, hemmen, die auf demselben Lipidträger basieren. Zur Bestätigung haben wir gezeigt, dass die Deletion des für WcaJ kodierenden Gens, das den ersten festgelegten Schritt der Colansäure-Vorläufersynthese katalysiert, das Wachstum eines WcaI-Mutanten in Gegenwart von Ceftriaxon wiederherstellt (ergänzende Abbildung S6a). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Kapsel an sich für das Wachstum in Gegenwart von Ceftriaxon nicht essentiell ist, obwohl biosynthetische Enzyme der Colansäure essentiell sind, um eine verringerte PG-Synthese durch Sequestrierung des Lipidträgers zu verhindern.

Drei ECA-Polymere werden aus demselben C55-verknüpften Vorläufer zusammengesetzt (Abb. 5)44. ECAs, die aus 1 bis 14 Einheiten des Vorläufers bestehen, sind kovalent an Lipopolysaccharide (ECALPS) oder an Phosphatidylglyceride (ECAPGL) im äußeren Blättchen der Außenmembran gebunden. Freie zyklische ECAs (ECACYC), bestehend aus vier Einheiten, befinden sich im Periplasma.

a Synthese von ECA-Nukleotid-Zucker-Vorläufern. b Zusammenbau der ECA-Untereinheit, verknüpft mit dem Undecaprenyl-Lipid-Träger. c Polymerisation und Transport von ECAs zur Zelloberfläche. d Synthese von Kern-LPS-Nukleotid-Zucker-Vorläufern. e Montage des Kern-LPS. f LPS-Transport zur Zelloberfläche. Abkürzungen: C55-Undecaprenyl-Lipid-Träger; IM innere Membran; OM-Außenmembran; P-Phosphat.

Keines der drei ECA-Polymere war im −CRO-Zustand essentiell, da Transposon-Insertionen in Genen nachgewiesen wurden, die für Enzyme kodieren, die an der Synthese von Nukleotid-Zucker-Vorläufern beteiligt sind (Abb. 5a) und für den Zusammenbau der C55-verknüpften Trisaccharid-Untereinheit (Abb. 5b). Im Gegensatz dazu waren die meisten Enzyme im +CRO-Zustand essentiell, was darauf hindeutet, dass mindestens eines der drei ECA-Polymere für die Resistenz essentiell war (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). Die Synthese von ECALPS und ECACYC war für die Resistenz entbehrlich, da die Deletion der für die WaaL- und WzzE-Ligasen kodierenden Gene, allein oder in Kombination, für das Wachstum in Gegenwart von Ceftriaxon entbehrlich war (Abb. 5c; ergänzende Abb. S6b). Der Phänotyp der Doppelmutante weist auf das Fehlen einer Redundanz zwischen ECALPS und ECACYC für die Ceftriaxon-Resistenz hin. Durch Eliminierung deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Synthese von ECAPGL für die Resistenz wesentlich ist, obwohl dies nicht direkt festgestellt werden konnte, da die entsprechende Polymerase noch nicht identifiziert wurde.

Lipid A, substituiert durch zwei 3-Desoxy-d-manno-octulosonat-Reste, ist bekanntermaßen die minimale LPS-Einheit, die für das Wachstum von E. coli45 erforderlich ist. Dementsprechend waren die meisten Enzyme, die an seiner Synthese und seinem Transport zur Außenmembran beteiligt sind, unter den Bedingungen −CRO und +CRO essentiell (Abb. 5d – f). Nachgeschaltete Enzyme, die für die Synthese der ADP-l-glycero-d-manno-heptose-Untereinheit (RpiA, Rpe, GmhA, HldE, GmhB und HldD) verantwortlich sind, ermöglichen die Hinzufügung einer d-manno-Heptose zur Saccharidkette ( WaaC) und die Phosphorylierung dieses Rests (WaaP) waren nur im +CRO-Zustand essentiell. Die Zugabe eines zweiten d-Manno-Heptose- (WaaF) und eines d-Glucose-Rests (WaaG) war ebenfalls für die Resistenz wesentlich (Ergänzungsdatendatei 1b; Ergänzungsdatendatei 2). Die Enzyme, die die drei nachfolgenden Schritte beim Aufbau des äußeren Kerns (WaaQ, B und R) katalysieren, waren für ein optimales Wachstum im +CRO-Zustand erforderlich. Nur drei Enzyme des Signalwegs (WaaY, J und U) waren sowohl unter −CRO- als auch unter +CRO-Bedingungen vollständig entbehrlich. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Wachstum in Gegenwart von Ceftriaxon nicht mit einer unvollständigen LPS-Synthese vereinbar war.

Die Spot-Assays ergaben, dass das Wachstum im +CRO-Zustand mit einem mukoiden Phänotyp verbunden war, einem Phänotyp, der bekanntermaßen auf die Überproduktion von Kolansäuren durch gestresste Zellen zurückzuführen ist. Diese Beobachtung lässt die formale Möglichkeit aufkommen, dass die Essentialität der ldcA-, dapF-, ECAPGL- und LPS-Kernzucker im +CRO-Zustand (oben) von der Überproduktion von Colansäuren durch Bakterien abhängen könnte, die Ceftriaxon ausgesetzt sind. Dies war nicht der Fall, da ldcA, dapF, wecA und waaC in ΔwcaJ-Stämmen, denen die Colansäuresynthese fehlt, weiterhin essentiell blieben (ergänzende Abbildung S6c).

Das E. coli-Genom kodiert für sechs Mitglieder der LDT-Proteinfamilie (ergänzende Abbildung S1). YcbB und YnhG katalysieren die Bildung von 3 → 3-Vernetzungen, während ErfK, YbiS und YcfS für die kovalente Verknüpfung des Braun-Lipoproteins (Lpp) mit PG10,11 verantwortlich sind. Das verbleibende Enzym, YafK, hydrolysiert die von ErfK, YbiS und YcfS gebildete Lpp-PG-Verbindung und setzt dadurch das Lipoprotein46,47 frei. Die Tn-seq-Analyse zeigte, dass das Braun-Lipoprotein sowohl unter −CRO- als auch unter +CRO-Bedingungen für das Wachstum entbehrlich ist. Analysen der PG-Struktur ergaben, dass das Wachstum in Gegenwart von Ceftriaxon die Verankerung des Braun-Lipoproteins an PG drastisch reduzierte (ergänzende Abbildung S7). Western-Blot-Analysen zeigten, dass die Lpp-Synthese im +CRO-Zustand nicht reduziert war (ergänzende Abbildung S7g). Somit kann Ceftriaxon die durch LDTs ​​katalysierte Verankerungsreaktion hemmen (ergänzende Abbildung S1), es ist jedoch unwahrscheinlich, dass diese Hemmung direkt erfolgt, da LDTs ​​durch β-Lactame nicht wirksam gehemmt werden, mit Ausnahme derjenigen, die zur Carbapenem-Klasse gehören 23, 24.

Jede Hypothese über die Art der Hemmung der Lpp-Verankerung an PG durch β-Lactame sollte die Tatsache berücksichtigen, dass LDTs ​​für die PG-Vernetzung (YcbB und YnhG) und für die Lpp-Verankerung (ErfK, YbiS und YcfS) mit denselben interagieren Donorsubstrat, ein Tetrapeptid-Donorstamm, im ersten katalytischen Schritt, der den beiden Arten von l, d-Transpeptidierungsreaktionen gemeinsam ist (ergänzende Abbildung S1b, S1c)12. Im zweiten Schritt reagieren die resultierenden Acylenzyme entweder mit einem Peptidoglycan-Stamm unter Bildung von 3→3-Vernetzungen oder mit Lpp unter kovalenter Verknüpfung des Lipoproteins mit PG. Das gemeinsame Substrat des ersten Schritts der Transpeptidierungsreaktionen impliziert, dass die Konkurrenz von LDTs ​​um denselben Tetrapeptiddonor, wie zuvor vorgeschlagen47, dazu beitragen könnte, die Verankerung des Braun-Lipoproteins an PG zu begrenzen. Dies erscheint jedoch im Zusammenhang mit einer YcbB-vermittelten Ceftriaxon-Resistenz unwahrscheinlich, da der hohe Anteil an 3 → 3-Vernetzungen im +CRO-Zustand (40 %) die Verankerung von Lpp nicht beeinträchtigte (ergänzende Abbildung S7). Daher kann eine beeinträchtigte Lpp-Verankerung in Gegenwart von Ceftriaxon auf eine andere indirekte Hemmwirkung von Ceftriaxon auf die Aktivität von ErfK, YbiS und YcfS zurückzuführen sein, beispielsweise auf die Bildung ihres Tetrapeptidsubstrats durch ein Partnerenzym oder die Stimulierung der Freisetzung von das Lipoprotein von YafK.

Nachdem wir die Rolle der Außenmembrankomponenten für die Integrität der Außenmembran in Gegenwart von Ceftriaxon untersucht hatten, bestand unser nächstes Ziel darin, ihre Funktionalität als Permeabilitätsbarriere zu bestimmen. In Abwesenheit von Induktoren von ycbB und relA' wurde die Hydrolyse von Chlorphenolrot-β-d-galactopyranosid (CPRG) durch die zytoplasmatische LacZ-β-Galactosidase in einem schmalen Ring am Rand der Ceftriaxon-Hemmzone nachgewiesen (Abb. 6a). . Daher führte die Exposition gegenüber subinhibitorischen Konzentrationen nahe der minimalen Hemmkonzentration (MHK) des Arzneimittels zu einer erhöhten Permeabilität, da es keinen spezifischen Transporter für CPRG gibt. Bei der Induktion von ycbB und relA' wurde LacZ-Aktivität in einer großen Zone nachgewiesen, was zeigt, dass Ceftriaxon die Permeabilität bei Konzentrationen erhöhte, die viel niedriger waren als die MHK dieses Stamms. Wachstum in Gegenwart von Ceftriaxon sensibilisierte die Bakterien gegenüber Natriumdodecylsulfat (SDS), was zu einer > 40-fachen Reduzierung der MHK des Detergens führte (Abb. 6b). Wachstum in Gegenwart von Ceftriaxon erhöhte auch die Anfälligkeit für Vancomycin, Moenomycin, Bacitracin und Erythromycin, von denen bekannt ist, dass sie die äußere Membran gramnegativer Bakterien nur schlecht durchdringen (Abb. 6c). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Umgehung von PBPs durch YcbB mit der Permeabilisierung der Außenmembran in Gegenwart von Ceftriaxon verbunden war. Dies impliziert, dass die Wirkungsweise von β-Lactamen eine positive Schleife beinhalten könnte, in der die Bindung der Arzneimittel an ihre Ziele den Arzneimittelzugang zum Periplasma fördert. An diesem Prozess kann eine durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) verursachte Schädigung der Außenmembran beteiligt sein, da durch einen kolorimetrischen Test eine erhöhte Lipidperoxidation festgestellt wurde (ergänzende Abbildung S7h).

a Hydrolyse von chromogenem CPRG bei 20 µg/ml durch zytoplasmatisches LacZ63. Die Scheiben wurden mit 30 µg Ceftriaxon beladen. b Beschichtungseffizienz in Gegenwart von SDS. Das Wachstum wurde in Gegenwart von Ceftriaxon in einer Konzentration von 8 µg/ml (+Ceftriaxon) oder in Abwesenheit des Arzneimittels (−Ceftriaxon) auf BHI-Agarplatten, ergänzt mit 40 µM IPTG und 1 % l-Arabinose zur Induktion von ycbB und relA, getestet. , jeweils. c Hemmungsdurchmesser von Arzneimitteln, die die äußere Membran von Wildtyp-E. coli nicht durchdringen. Die Werte sind der Median von drei biologischen Wiederholungen. d Kaskade von Ereignissen, die aufgrund der Inaktivierung von PBPs durch β-Lactame zum Zelltod von Bakterien führen. e Rettung der PBP-Inaktivierung durch die YcbB l,d-Transpeptidase. Abkürzungen: IM innere Membran; OM-Außenmembran; Lpp Braun-Lipoprotein; OMPs äußere Membranproteine. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Ziele von β-Lactamen und der Mechanismus ihrer Inaktivierung sind seit Jahrzehnten bekannt, und dennoch ist das Verständnis der nachgeschalteten Ereigniskaskade, die zum Zelltod von Bakterien führt, noch immer unzureichend. Das neueste Modell (Abb. 6d) legt nahe, dass die Inaktivierung von PBPs zur Produktion unvernetzter Glykanketten im Periplasma und zu deren anschließender Spaltung durch lytische Enzyme führt19,21. Der durch diesen vergeblichen Zyklus aus PG-Synthese und -Abbau erzeugte anabole Bedarf führt zu Veränderungen im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel, der Proteinsynthese und der ATP-Nutzung, was zur Produktion von ROS führt, die Biomoleküle, einschließlich DNA, RNA, Proteine ​​und Lipide, schädigen. Der daraus resultierende oxidative Stress trägt zum Zelltod bei18,48.

Die Rettung der PBP-Inaktivierung durch YcbB impliziert im einfachsten Sinne eine Umgehung der Vernetzungsaktivität von PBPs durch den Ersatz von 4 → 3 durch 3 → 3 Vernetzungen (Abb. 1). Unsere Analyse zeigt jedoch, dass die β-Lactam-Resistenz deutlich komplexer ist, da die toxischen Wirkungen der Inaktivierung von PBPs trotz der Umgehung ihrer d,d-Transpeptidase-Aktivität durch YcbB bestehen blieben. Übereinstimmend wurde im +CRO-Zustand eine erhöhte Lipidperoxidation festgestellt (ergänzende Abbildung S7h). Die im +CRO-Zustand als selektiv essentiell identifizierten Gene (Abb. 2; Ergänzungsdatendatei 1b) zeigten die Komplexität der Funktionen, die zur Abschwächung dieser toxischen Wirkungen mobilisiert werden (Abb. 6e).

Es wurde zuvor gezeigt, dass die Entkopplung der RodA-vermittelten Transglykosylierung von der PBP2-vermittelten Transpeptidierung nach Inaktivierung dieses PBP durch β-Lactame gegensätzliche Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit anfälliger und resistenter Bakterien hat. Bei anfälligen Bakterien ist die Ansammlung unvernetzter Glykanstränge nach der PBP2-Inaktivierung durch β-Lactame schädlich und ihr Abbau durch die lytische Transglycosylase SltY trägt zum Überleben der Zellen bei21. Im Gegensatz dazu begünstigt die Inaktivierung von SltY die YcbB-vermittelte Resistenz gegen β-Lactame, wobei unvernetzte Glykanstränge, die vom Elongasom-Komplex gebildet werden, als geeignete Substrate für den Aufbau eines funktionellen PG-Polymers dienen7. Pulsmarkierungsexperimente zeigten, dass YcbB die PG-Polymerisation über einen zweistufigen Mechanismus unterstützte, der (i) den Zusammenbau von 3 → 3 vernetzten Glykansträngen und anschließend (ii) die Insertion des resultierenden neu synthetisierten Polymers in das vorhandene PG49 umfasst. In der vorliegenden Arbeit liefern wir direkte Beweise dafür, dass diese Art der Peptidoglycan-Polymerisation ein funktionelles Elongasom erfordert, das die Glykanstrang-Polymerisation durch katalytisch aktives RodA unterstützt (Abb. 3).

Das PG-Recycling wird im +CRO-Zustand stimuliert49. Dies impliziert, dass die Rettung von PBPs durch YcbB den hohen anabolen Bedarf verringert, der erforderlich ist, um den PG-Assemblierungsweg in Gegenwart des Arzneimittels zu versorgen, aber nicht aufhebt. Hier zeigen wir, dass die Verringerung des Stoffwechselflusses von Vorläufern im PG-Assemblierungsweg nicht mit der YcbB-vermittelten β-Lactam-Resistenz vereinbar ist. Dies war bei dapF- oder ldcA-Deletionen der Fall, was zur Synthese von aberranten Vorläufern führte, die l,l-DAP bzw. einen Tetrapeptidstamm enthielten (Abb. 4a). Dies galt auch für die Inaktivierung von Genen, die für Colansäure-Syntheseenzyme kodieren, was zur Sequestrierung des Undecaprenyl-Lipidträgers führte, der konkurrenzfähig für die PG-Synthese verwendet wurde (Abb. 4b – d). Der verbleibende Überschuss des anabolen Bedarfs kann auch Konsequenzen haben, die nicht direkt mit der Wirksamkeit der PG-Synthese zusammenhängen. Tatsächlich bedeutet ein erhöhter anaboler Bedarf, dass die ROS-Produktion erhöht bleibt. Die erfolgreiche Abwehr des daraus resultierenden oxidativen Stresses könnte für die selektiv wesentliche Rolle von Regulatoren, Chaperonen und Enzymen verantwortlich sein, die an der Reparatur von Makromolekülen beteiligt sind (Abb. 2e; ergänzende Datendatei 1b).

Überraschenderweise stellten wir fest, dass die Resistenz auch von ECAPGL (Abb. 5a), LPS mit einem vollständigen Kernzucker (Abb. 5b – d), von Komponenten des Tol-Pal-Systems (Abb. 3a) und von Proteinen der äußeren Membran abhängt, einschließlich OmpA und OmpC (Ergänzungsdatendatei 1b; Ergänzungsdatendatei 2). Analysen der Bakterienmorphologie zeigten kürzlich, dass die äußere Membran direkt zu den mechanischen Eigenschaften der Zellhülle beiträgt, eine Rolle, die in der Vergangenheit ausschließlich der PG-Schicht zugeschrieben wurde50,51. Bemerkenswerterweise gehörten zu den stabilisierenden Komponenten, die in einem dieser früheren Berichte50 identifiziert wurden und für die Steifheit der Außenmembran wesentlich sind, LPS mit einem vollständigen Kernzucker, das Tol-Pal-System und OmpA, das hier ebenfalls als wesentlich für die YcbB-vermittelte Ceftriaxon-Resistenz identifiziert wurde. Daher erforderte der Aufbau einer funktionellen Hülle in Gegenwart von Ceftriaxon sowohl die Umgehung der d,d-Transpeptidase-Aktivität von PBPs durch die l,d-Transpeptidase-Aktivität von YcbB als auch die Insertion kritischer Polymere in die äußere Membran.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Rettung von PBPs durch YcbB in Verbindung mit einem genomweiten Tn-seq-Screening zwei unerwartete Auswirkungen von β-Lactamen offenbarte. Erstens verhinderte die Exposition gegenüber Ceftriaxon die l,d-Transpeptidase-vermittelte Verankerung des Braun-Lipoproteins an PG (ergänzende Abbildung S7). Zweitens erhöhte die Exposition gegenüber Ceftriaxon die Durchlässigkeit der äußeren Membran (Abb. 6). Der letztgenannte Effekt impliziert, dass die selbstvermittelte Penetration durch die äußere Membran ein bisher unerkannter Aspekt der Wirkungsweise von β-Lactamen ist. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass der durch β-Lactam induzierte vergebliche Zyklus nur dann nachhaltig war, wenn die Wirksamkeit des Peptidoglycan-Zusammenbauwegs nicht durch ineffektive Biosyntheseschritte oder durch Konkurrenz mit dem Zusammenbau anderer Polymere, die auf dem gemeinsamen Undecaprenyl-Lipidträger basieren, beeinträchtigt wurde. Das durch YcbB vernetzte PG war funktionsfähig, obwohl die Integrität der Zellhülle stark von Polymeren der Außenmembran abhing, die ansonsten für das Wachstum entbehrlich waren. Somit lieferte die Identifizierung der Gene, die an der Rettung von PBPs durch YcbB beteiligt sind, ein positives Screening zur Identifizierung bakterieller Reaktionen, die die Abtötung von Bakterien durch β-Lactame verhindern. Im Gegensatz dazu sind Stoffwechselanalysen, die auf anfällige Bakterien beschränkt sind, unempfindlich gegenüber Unterschieden zwischen antibakteriellen spezifischen Störungen und der Vielzahl von Nebenwirkungen im Zusammenhang mit dem Zelltod19. Dementsprechend liefert unsere Analyse überzeugende Beweise dafür, dass die äußere Membran über ihre bekannte Rolle als Permeabilitätsbarriere52 hinaus eine Schlüsselrolle bei der Wirkungsweise von β-Lactamen und bei der l,d-Transpeptidase-vermittelten β-Lactam-Resistenz spielt. wie bereits zuvor für die Toleranz gegenüber diesen Arzneimitteln bei verschiedenen Bakterienarten festgestellt53,54,55,56. Im Gegenzug identifiziert unsere Analyse potenziell umsetzbare Ziele, um die Wirksamkeit von β-Lactamen gegen resistente Bakterien zu steigern.

Die Eigenschaften und Herkunft der in der Studie verwendeten Plasmide und Stämme sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Die Bakterien wurden bei 37 °C in Hirn-Herz-Infusionsagar (BHI; Difco) oder Brühe unter Belüftung (Schütteln bei 180 U/min) gezüchtet. Für die Selektion von Transduktanten, die die aus der Keio-Sammlung erhaltene KmR-Kassette tragen, wurde Kanamycin in einer Konzentration von 50 µg/ml verwendet. Die Wachstumsmedien wurden systemisch mit Arzneimitteln ergänzt, um dem Plasmidverlust entgegenzuwirken: 10 µg/ml Tetracyclin für Plasmid pKT2, 20 µg/ml Chloramphenicol für pKT8, 25 µg/ml Zeocin für pHV30 und Derivate. Die Induktion der Ptrc-, ParaBAD- und PrhaBAD-Promotoren erfolgte mit Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG, 40 µM), L-Arabinose (1 %) bzw. L-Rhamnose (0,2 %). Die in dieser Studie konstruierten Plasmide wurden, sofern nicht anders angegeben, mithilfe der NEBuilder HiFi-DNA-Assemblierungsmethode (New England Biolabs) erhalten. Deletionen spezifischer Gene wurden durch P1-Transduktion der KmR-Kassette ausgewählter Mutanten aus der Keio-Sammlung erhalten57,58. Bei mehreren Gendeletionen wurde die KmR-Kassette durch die vom Plasmid pCP20 kodierte FLT-Rekombinase entfernt.

Eine frische Kolonie von Escherichia coli BW25113 ΔrelA pKT2(ycbB) pKT8(relA') wurde in 10 ml BHI-Brühe, ergänzt mit 10 µg/ml Tetracyclin und 20 µg/ml Chloramphenicol, gezüchtet. Bei einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600nm) von ca. 0,8, Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und viermal mit 10 ml H2O bei 4 °C gewaschen. Mehrere Elektroporationen (siehe unten) wurden mit 100 µl elektrokompetenten Zellen und 1 µl EZ-Tn5 < KAN-2> Transposome® (Lucigen) durchgeführt. Für jede Elektroporation wurden transformierte Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C in 2 ml BHI-Brühe, ergänzt mit 10 µg/ml Tetracyclin und 20 µg/ml Chloramphenicol, inkubiert. Die Zellen wurden auf 20 BHI-Agarplatten (100 µl pro Platte), ergänzt mit 50 µg/ml Kanamycin, 40 µM IPTG und 1 % L-Arabinose, in Abwesenheit (Bedingung –CRO) oder Anwesenheit (Bedingung +CRO) von 8 µg ausplattiert /ml Ceftriaxon. Die Platten wurden 16 Stunden (Bedingung –CRO) oder 24 Stunden (Bedingung +CRO) bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden aus Sätzen von 20 Platten (entsprechend der gleichen Elektroporation) in zwei Schritten durch Ausspülen mit 4 ml BHI-Brühe, die 20 % Glycerin enthielt, gewonnen, gefolgt von einem zusätzlichen Waschen der Platten mit 4 ml des gleichen Mediums. Die für jede Elektroporation erhaltenen Bakteriensuspensionen wurden bei –80 °C aufbewahrt. Für die −CRO-Bedingung wurden in 7 Elektroporationen insgesamt 810.000 KBE erhalten. Für die +CRO-Bedingung wurden in 10 Elektroporationen insgesamt 260.000 KBE erhalten.

Für die DNA-Extraktion wurden 10 µl der Bakteriensuspensionen, die in den 7 (−CRO-Bedingung) oder 10 (+CRO-Bedingung) Elektroporationen erhalten wurden, gepoolt. Die DNA-Extraktion wurde mit dem Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) in zweifacher Ausfertigung durchgeführt, um technische Wiederholungen zu erhalten.

Die Erstellung der DNA-Bibliotheken und die Illumina-Sequenzierung wurden von der Firma Viroscan3D und der ProfileXpert-Plattform der Université de Lyon 1 durchgeführt. Kurz gesagt wurde die DNA fragmentiert (ca. 300 bp) und P5-Illumina-Adapter wurden mit der fragmentierten DNA verknüpft. Verbindungsfragmente auf beiden Seiten von EZ-Tn5 wurden unter Verwendung des Standard-P5-Illumina-Primers in Verbindung mit dem Tn5-Hybridisierungsprimer HV1 oder HV2, der den P7-Illumina-Adapter am 5'-Ende trägt, amplifiziert (Ergänzungstabelle S1). Die Indizes wurden von den Tn-Links- oder Tn-Rechts-Primern getragen. Die Illumina-Sequenzierung wurde auf einem NextSeq Mid Output 150 bp (Paired-End: 40–110) durchgeführt. Das Demultiplexen und Trimmen der Lesevorgänge wurde vor dem Alignment mit dem Referenzgenom von E. coli BW25113 (NCBI-Zugangsnummer: CP009273) durchgeführt.

Die Analyse wurde mit dem Python (v.3.7)-Paket TRANSIT (v.3.0+)59 durchgeführt. Die TPP-Komponente wurde verwendet, um rohe experimentelle Messwerte zu verarbeiten und WIG-Dateien für die nachgelagerte Analyse zu generieren. Illumina-Paired-Ends-Reads mit EZ-Tn5-Insertionsstellen wurden identifiziert, indem zunächst diejenigen mit der erwarteten „TAAGAGACAG“-Transposon-Endsequenz zwischen den Nukleotiden 25 und 50 jedes Reads ausgewählt wurden. In allen Fällen wurde die 110-bp-Reverse-Sequenz (Adapter-P7-Sequenzierungsprimer) verwendet, da sie sowohl EZ-Tn5- als auch genomische Sequenzen enthielt. EZ-Tn5-Reads wurden dann mit BWA (v.0.7.17)60 auf die Referenzsequenz E. coli BW25113 abgebildet. Für jedes Experiment wurden kombinierte WIG-Dateien generiert, die den linken und rechten Verbindungsstellen entsprechen. Transposon-Insertionsereignisse wurden bestimmten offenen Leserahmen/Genen mithilfe der GFF3-Datei GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) zugeordnet, die der FASTA-Genomsequenz entspricht. Die Normalisierung der Anzahl der Inserts pro ORF/Gen wurde durch Trimmed Total Reads (TTR) durchgeführt: Die Gesamtzahl der Lesevorgänge wurde normalisiert, nachdem die oberen und unteren 5 % der Lesezahlen gekürzt wurden. Für jede Versuchsbedingung wurden mittlere Einfügungszahlen berechnet: Mittelwert der linken und rechten Verbindungen aus jedem der beiden Experimente.

Die Verbindungsfragmente wurden mit dem Referenzgenom von E. coli BW25113 abgeglichen und die essentiellen Gene wurden mithilfe des Tn5Gaps-Algorithmus der TRANSIT-Pipeline (Supplementary Data File 1a)59 aufgerufen. Der Satz selektiv essentieller Gene im +CRO-Zustand wurde wie folgt konstruiert: (1) Identifizierung von Genen, die in den beiden Replikaten des +CRO essentiell und in den beiden Replikaten des −CRO nicht essentiell sind (Untergruppe 1). (2) Hinzufügen von Genen mit einer Diskrepanz zwischen technischen Duplikaten, z. B. als nicht essentiell in einem +CRO-Datensatz oder als essentiell in einem −CRO-Datensatz (Teilsatz 2) markiert. (3) Die durchschnittlichen Reads pro Gen wurden berechnet, um Transposon-Insertionen zu identifizieren, die im +CRO-Zustand (Supplementary Data File 1a) signifikant (p-Wert < 0,05) unterrepräsentiert sind. Gene aus den Teilmengen 1 und 2, die einen p-Wert > 0,05 oder einen Fold-Change < 4 ergaben, wurden eliminiert. Der resultierende Satz von 179 Genen ist in der Ergänzungsdatendatei 1b aufgeführt. Für Pfade oder Gencluster, die im +CRO-Zustand selektiv essentielle Gene enthalten, haben wir auch nicht-essentielle Gene berücksichtigt, die im +CRO-Zustand eine deutlich reduzierte Anzahl von Insertionen aufweisen (p < 0,05). Es wurde angenommen, dass diese Gene Fitnesskosten verursachen.

Die 20-Nukleotid-Leitsequenzen, die auf mrdA (GTCTACAGTTAAACCCTATG) und rodA (GGTGGCTGCACAGCCTGACC) abzielen, wurden unabhängig voneinander durch invertierte PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer HV3 und HV4 oder HV5 und HV6 (Ergänzungstabelle S1) in das Plasmid pTargetF61 eingeführt, um pTargetF-mrdA und pTargetF-rodA zu erzeugen , jeweils. Kurz gesagt, pTargetF wurde durch PCR mit Phusion-DNA-Polymerase (Thermo Scientific) amplifiziert, die PCR-Produkte wurden mit dem Restriktionsenzym DpnI (Thermo Scientific) verdaut und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Gereinigte PCR-Produkte wurden phosphoryliert und mit der T4-Polynukleotidkinase und der T4-DNA-Ligase (Thermo Scientific) in einer Eintopfreaktion ligiert, und die resultierenden pTargetF-mrdA- und pTargetF-rodA-Plasmide wurden durch Elektroporation in E. coli TOP10 eingeführt.

Die Donor-DNAs mrdA S330A, mrdA S330C, rodA D159A, rodA D159N, ΔmrdA und ΔrodA wurden von GeneCust synthetisiert und in pUC57 kloniert. Spender-DNAs, die zur Einführung von Punktmutationen verwendet werden, entsprechen der Sequenz von mrdA oder rodA mit Missense-Mutation im interessierenden Codon und stillen Mutationen in der Sequenz, die den 20 Nukleotiden entspricht, die zur Führung von Cas9 auf der chromosomalen Kopie des Gens verwendet werden (um weitere Mutationen zu verhindern). Spaltung durch Cas9 nach Allelaustausch). Zur Einführung von Deletionen verwendete Spender-DNAs entsprechen den 100 bp stromaufwärts gelegenen, den ersten sechs Codons, den letzten acht Codons und den 100 bp stromabwärts gelegenen Sequenzen von mrdA oder rodA. Die Spender-DNAs wurden unabhängig durch PCR mit Phusion-DNA-Polymerase (Thermo Scientific) und den in der Ergänzungstabelle S1 dargestellten Primern HV7 bis HV14 amplifiziert. PCR-Produkte wurden mit dem Restriktionsenzym DpnI (Thermo Scientific) verdaut und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt.

Methode angepasst von Jiang Y. et al.61. Eine frische Kolonie von E. coli BW25113 ΔrelA pKT8(relA') pCas wurde bei 30 °C unter Rühren in 10 ml BHI-Brühe, ergänzt mit 1 % l-Arabinose, gezüchtet, um die Expression sowohl von relA' als auch des λ Red-Systems zu induzieren mit 20 µg/ml Chloramphenicol und 50 µg/ml Kanamycin, um dem Verlust der Plasmide entgegenzuwirken. Bei einer OD600nm von ca. 0,8, Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und viermal mit 10 ml H2O bei 4 °C gewaschen. Bakterien wurden mit dem Plasmid pTargetF-mrdA und der Donor-DNA mrdA S330A, mrdA S330C oder ∆mrdA oder mit dem Plasmid pTargetF-rodA und der Donor-DNA rodA D159A, rodA D159N oder ∆rodA mit einem Molekularverhältnis von 1 Plasmid für 5000 Donor-DNA elektroporiert Moleküle. Transformierte Zellen wurden 2 Stunden lang bei 30 °C in 1 ml BHI-Brühe, ergänzt mit 1 % L-Arabinose, 20 µg/ml Chloramphenicol und 50 µg/ml Kanamycin, inkubiert. Die Bakterien wurden auf BHI-Agar, ergänzt mit 1 % L-Arabinose, 50 µg/ml Kanamycin und 120 µg/ml Spectinomycin, ausplattiert und 24 Stunden bei 30 °C inkubiert. Um pTargetF-mrdA oder pTargetF-rodA loszuwerden, wurden Transformanten auf demselben Medium isoliert, das zusätzlich mit 500 µM IPTG zur Induktion der pCas-kodierten sgRNA, die auf das pTargetF-Plasmid abzielte, ergänzt und 24 Stunden lang bei 30 °C inkubiert wurde. Die chromosomalen Deletionen oder Punktmutationen wurden durch PCR und Sanger-Sequenzierung verifiziert. Um das wärmeempfindliche pCas-Plasmid zu entfernen, wurden Klone, die die erwarteten Mutationen enthielten, in BHI-Brühe, ergänzt mit 1 % L-Arabinose und 500 µM IPTG, 6 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet und auf BHI-Agar, ergänzt mit 1 % L-Arabinose, isoliert 37 °C für 16 Stunden. Isolierte Klone wurden in BHI-Brühe, ergänzt mit 1 % L-Arabinose, 6 Stunden lang bei 37 °C subkultiviert und auf BHI-Agar, ergänzt mit 1 % L-Arabinose, 16 Stunden lang bei 37 °C isoliert. Die Empfindlichkeit isolierter Klone gegenüber Spectinomycin (Verlust von pTargetF-Derivaten) und Kanamycin (Verlust von pCas) wurde getestet, um den Verlust dieser Plasmide zu bestätigen.

Die Bakterien wurden bis zur späten exponentiellen Phase gezüchtet, dh bis zu einer OD600nm von 1,0 bis 4,0 (ca. 6 Stunden bei 37 °C unter kräftigem Schütteln). Die OD600nm wurde auf 1,0 eingestellt und 10-fache Verdünnungen (10–1 bis 10–5) wurden in BHI-Brühe hergestellt. Fünf µl der resultierenden Bakteriensuspensionen wurden auf BHI-Agarplatten getupft, denen Induktoren und Arzneimittel zugesetzt waren, wie in der Legende zu den Abbildungen angegeben. Für den Scheibendiffusionstest wurden 5 µl der Bakteriensuspension mit einer OD600 nm von 1,0 in 5 ml Wasser beimpft. BHI-Agarplatten wurden mit der letztgenannten Suspension geflutet, überschüssige Flüssigkeit entfernt und die Platten 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, bevor antibiotikahaltige Papierscheiben hinzugefügt wurden. Für den Chlorphenolrot-β-d-galactopyranosid (CPRG)-Assay wurde der Stamm BW25113(ycbB, relA') mit pHV30bis(lacZ) verwendet, da der Elternstamm BW25113 die chromosomale Kopie von lacZ nicht exprimiert. Nach 16 Stunden (bzw. 24 Stunden bei Platten mit Ceftriaxon) Inkubation bei 37 °C wurden Platten bebildert oder die Hemmdurchmesser gemessen. Die in den Abbildungen gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens zwei biologische Wiederholungen und die gemessenen Hemmungsdurchmesser sind der Median von drei biologischen Wiederholungen.

Bakterien wurden in BHI-Brühe bis zur späten exponentiellen Phase gezüchtet, dh bis zu einer OD600nm von mehr als 1,0 (ca. 6 Stunden bei 37 °C unter Rühren). Zehn µl der resultierenden Bakteriensuspensionen wurden auf BHI-Agar, ergänzt mit Induktoren (40 µM IPTG und 1 % L-Arabinose) und Arzneimitteln (10 µg/ml Tetracyclin und 20 µg/ml Chloramphenicol oder 8 µg/ml Ceftriaxon), ausplattiert. Für jede Wiederholung wurden 5 BHI-Agarplatten verwendet, um eine ausreichende Menge an Bakterien zu erhalten. Die Platten wurden 16 Stunden lang (oder 24 Stunden für Platten, die Ceftriaxon enthielten) bei 37 °C inkubiert. Die Bakterien wurden in zwei Schritten geerntet, indem jede Platte mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,2 abgewischt und anschließend die Platte zusätzlich mit 1 ml PBS gewaschen wurde. Die Bakterien wurden in 0,5 × PBS, ergänzt mit 4 % Natriumdodecylsulfat (SDS), in einem Endvolumen von 20 ml 1 Stunde lang gekocht. Sacculi wurden durch Zentrifugation (20.000 × g für 20 Minuten bei 20 °C) geerntet, fünfmal mit 20 ml Wasser gewaschen, in 1 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, resuspendiert und mit 100 µg/ml Pronase bei 37 °C inkubiert °C für 16 Stunden. Sacculi wurden fünfmal mit 1 ml Wasser gewaschen, in 1 ml 20 mM Natriumphosphat, pH 8,0, resuspendiert und mit 100 µg/ml Trypsin 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Sacculi wurden fünfmal mit 1 ml Wasser gewaschen, 5 Minuten gekocht, durch Zentrifugation gesammelt, in 300 µl Wasser resuspendiert und bei –20 °C gelagert.

Zehn µl gereinigte Sacculi wurden mit 120 µM Lysozym in 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 16 Stunden lang bei 37 °C verdaut. Unlösliches Material wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 20.000 × g in einer Mikrozentrifuge entfernt, und die lösliche Fraktion, die Muropeptide enthielt, wurde mit Natriumborhydrid in 125 mM Boratpuffer, pH 9, 0, 1 Stunde bei Raumtemperatur reduziert. Mit Phosphorsäure wurde der pH-Wert auf 4,0 eingestellt. Muropeptide wurden durch rpHPLC in einer C18-Säule (Hypersil GOLD aQ; 250 × 4,6 mm; 3 µm, Thermo Scientific) bei einer Flussrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten (0–20 %) zwischen 10 und 60 min getrennt (Puffer A, TFA 0,1 %; Puffer B, Acetonitril 99,9 %, TFA 0,1 %, v/v). Die Absorption wurde bei 205 nm überwacht und die Fraktionen wurden gesammelt, lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und mittels Massenspektrometrie analysiert. Massenspektren wurden mit einem hochauflösenden Massenspektrometer Bruker Daltonics maXis (Bremen, Deutschland) im Positivmodus (Analyseplattform des Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris, Frankreich) aufgenommen. Massenspektraldaten wurden mit mineXpert262 untersucht.

BW25113(ycbB, relA') wurde unter −CRO- und +CRO-Bedingungen in BHI-Agarplatten gezüchtet, wie es für die Herstellung von Sacculi durchgeführt wurde. Die Bakterien wurden mit 4 % SDS 45 Minuten lang bei 96 °C lysiert. Rohe Bakterienextrakte wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Lpp und RpoA (als Ladungskontrolle verwendet) wurden mit polyklonalen Kaninchen- und Mausantikörpern nachgewiesen, die von JF Collet bzw. C. Beloin bereitgestellt wurden. Primärantikörper wurden auf 1/10.000 (v/v) verdünnt. Der Nachweis wurde mit Peroxidase-gekoppelten Anti-Kaninchen- (Sigma) und Anti-Maus-Antikörpern (Sigma) gemäß den Herstelleranweisungen des PierceTM ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) durchgeführt. Sekundärantikörper wurden auf 1/2000 (v/v) verdünnt.

BW25113(ycbB, relA') wurde bei 37 °C in BHI-Brühe, ergänzt mit 40 µM IPTG und 1 % L-Arabinose, gezüchtet, um die Expression von ycbB bzw. relA' zu induzieren. Bei einer OD600nm von ca. 0,25 Ceftriaxon wurden hinzugefügt und die Inkubation wurde 2 Stunden lang fortgesetzt. Bakterien (1 ml) wurden geerntet, lysiert und die Konzentration von Malondialdehyd (MDA) wurde gemäß den Herstelleranweisungen des Lipid Peroxidation MDA Assay Kit (Sigma) bestimmt.

Bei der Tn-seq-Analyse wird die Reproduzierbarkeit durch die Korrelation der normalisierten durchschnittlichen Lesezahlen pro CDS für zwei sequenzierte technische Replikate berücksichtigt, die für die Bedingungen −CRO und +CRO erhalten wurden (Abb. 2a, b). Die statistische Behandlung der Tn-seq-Daten wird unter der Überschrift „Bestimmung der Gen-Essentialität und der Fitnesskosten“ im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. p-Werte wurden aus ungepaarten zweiseitigen t-Tests erhalten. Für die Plattierungseffizienztests wurden mindestens zwei biologische Wiederholungen durchgeführt (die Daten in den Abbildungen stammen aus einem repräsentativen Experiment). Für die Peptidoglycan-Analyse mittels rpHPLC und Massenspektrometrie wurden drei unabhängige biologische Wiederholungen durchgeführt (die Daten in den Abbildungen stammen aus einem repräsentativen Experiment). Die Daten zur Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung sind Mediane aus drei unabhängigen biologischen Wiederholungen. Für die Western-Blot-Analyse sind die Bilder jeweils ein Repräsentant von drei biologischen Wiederholungen. Die Konzentrationen von Malondialdehyd (MDA) sind der Mittelwert und die Standardabweichung von drei biologischen Wiederholungen. p-Werte wurden aus ungepaarten zweiseitigen t-Tests erhalten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Tn-seq-Daten wurden in der Sequence Read Archive-Datenbank (SRA) unter dem Zugangscode PRJNA907050 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde von der französischen Nationalen Forschungsagentur ANR „RegOPeps“ unterstützt (Zuschuss ANR-19-CE44-0007 an JEH). HV ist Empfänger eines Doktorandenstipendiums der Sorbonne-Université (ED 515, Complexité du Vivant). Wir danken J. Lachuer und J. Bertrand von der Genomplattform ProfileXpert/Viroscan3D für die Transposon-Insertionssequenzierung. Wir danken A. Marie für die technische Unterstützung bei der Sammlung von Massenspektren am Plateau Technique de Spectrométrie de Masse Bio-Organique des Muséum national d'Histoire Naturelle. Wir danken JF Collet und C. Beloin für die großzügige Spende von Anti-Lpp- bzw. Anti-RpoA-Antikörpern. Wir danken Z. Edoo und F. Rusconi für die kritische Lektüre des Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Michel Arthur, Jean-Emmanuel Hugonnet.

Forschungszentrum Cordeliers, Universität Sorbonne, Inserm, Universität Paris Cité, F-75006, Paris, Frankreich

Henri Voedts, Guennadi Sezonov, Michel Arthur und Jean-Emmanuel Hugonnet

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Abteilung für Computational Biology, F-75015, Paris, Frankreich

Sean P. Kennedy

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HV: Konzeption und Design, Erfassung, Analyse und Interpretation von Daten, Entwurf und Überarbeitung des Artikels. SK: Datenanalyse, Verfassen und Überarbeiten des Artikels. GS: Verfassen und Überarbeiten des Artikels. MA und JEH: Konzeption und Design, Analyse und Interpretation von Daten, Entwurf und Überarbeitung des Artikels.

Korrespondenz mit Michel Arthur oder Jean-Emmanuel Hugonnet.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Voedts, H., Kennedy, SP, Sezonov, G. et al. Die genomweite Identifizierung von Genen, die für die alternative Peptidoglycan-Vernetzung in Escherichia coli erforderlich sind, ergab unerwartete Auswirkungen von β-Lactamen. Nat Commun 13, 7962 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

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Eingegangen: 11. August 2022

Angenommen: 06. Dezember 2022

Veröffentlicht: 27. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

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