Ein Arg/Ala

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 311 (2023) Diesen Artikel zitieren

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MTB infiziert ein Viertel der Weltbevölkerung. Die meisten Medikamente zur Behandlung von Tuberkulose zielen auf Zellwachstum und Zellteilung ab. Mit zunehmender Arzneimittelresistenz wird es immer dringlicher, die Zellteilung von Mtb besser zu verstehen. Dieser Prozess beginnt mit der Bildung des Z-Rings durch Polymerisation von FtsZ und der Verankerung des Z-Rings an der inneren Membran. Hier zeigen wir, dass das Transmembranprotein FtsQ ein potenzieller Membrananker des Mtb-Z-Rings ist. In der ansonsten ungeordneten zytoplasmatischen Region von FtsQ wird eine Arg/Ala-reiche α-Helix mit 29 Resten gebildet, die mit vorgelagerten sauren Resten in Lösung und mit sauren Lipiden an der Membranoberfläche interagiert. Diese Helix bindet auch an die GTPase-Domäne von FtsZ, was Auswirkungen auf die Arzneimittelbindung und die Z-Ring-Bildung hat.

Bei Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist FtsQ ein essentielles Transmembranprotein, das an der Entwicklung des Divisoms beteiligt ist, der Maschinerie, die für die bakterielle Zellteilung verantwortlich ist1,2,3. Das Divisom besteht aus Dutzenden transmembranösen und wasserlöslichen Proteinen. Während seine Zusammensetzung von Organismus zu Organismus variieren kann, ist das Herzstück FtsZ, ein wasserlösliches Protein mit einer globulären GTPase-Domäne und einem ungeordneten C-Schwanz; Die GTPase-Domäne polymerisiert, um den Z-Ring zu bilden und die Zellteilung einzuleiten. Der Z-Ring muss über Wechselwirkungen mit Transmembranproteinen oder membrangebundenen wasserlöslichen Proteinen an der Innenmembran verankert sein. Während die für bakterielle FtsQ-Proteine ​​typische Escherichia coli-Version nur eine kurze N-terminale zytoplasmatische Region (27 Reste) aufweist, ist die Mtb-Version 99 Reste lang, vor einer einzelnen Transmembranhelix und einer vermeintlich C-terminalen periplasmatischen Region mit 191 Resten bildet eine POTRA-Domäne (oder Polypeptidtransport-assoziierte Domäne). Sowohl die zytoplasmatische als auch die periplasmatische Region sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Mtb-Zelllänge3. Die biophysikalische Charakterisierung der periplasmatischen Region ist umstritten, da die mechanistischen Eigenschaften der POTRA-Domänen für das Mtb-FtsQ-Protein4 noch nachgewiesen werden müssen. Hier konzentrieren wir uns auf die Charakterisierung der zytoplasmatischen Region Mtb FtsQ (FtsQ1-99) und demonstrieren deren intramolekulare Bindung in Lösung, an saure Membranen (die die innere Membran von Mtb nachahmen5) und an Mtb FtsZ.

Die Membranverankerung des Z-Rings ist in E. coli und Bacillus subtilis gut untersucht. Zwei Proteine, FtsA und ZipA in E. coli und FtsA und SepF in B. subtilis, fungieren jeweils als Membrananker6,7,8. ZipA ist ein Transmembranprotein9, wohingegen FtsA und SepF wasserlösliche Proteine ​​mit einer amphipathischen Helix zur Membranbindung sind10,11. FtsZ nutzt seinen ungeordneten C-Schwanz, um eine strukturierte Domäne in jedem dieser drei Proteine ​​zur Membranverankerung zu binden11,12,13. In E. coli sorgen FtsA und ZipA für Redundanz bei der Membranverankerung, da sich Z-Ringe bilden können, wenn einer von beiden fehlt, aber nicht beide6. Eine solche Redundanz wird ebenfalls durch FtsA und SepF in B. subtilis bereitgestellt8. Mtb hat jedoch SepF14,15, aber kein FtsA und verfügt möglicherweise aus Redundanzgründen über einen weiteren nicht identifizierten Membrananker des Z-Rings. SepF wurde als Membrananker des Z-Rings in Corynebacterium glutamicum16 und Mtb15,17 untersucht.

Mithilfe mehrerer komplementärer Techniken, darunter Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sowie Molekulardynamiksimulationen (MD), haben wir die Konformations- und dynamischen Eigenschaften von Mtb FtsQ1-99 in Lösung und seine Wechselwirkungen mit Membranen und Mtb FtsZ charakterisiert. Der Mittelteil von FtsQ1-99 bildet eine lange α-Helix (Reste 46–74), die reich an Arg- und Ala-Resten ist und mit N-terminalen sauren Resten interagiert. Diese Arg/Ala-reiche Helix bindet durch schwache hydrophobe, aber starke elektrostatische Wechselwirkungen an saure Membranen. Es bindet auch an die GTPase-Domäne von FtsZ und macht FtsQ dadurch zu einem potenziellen Membrananker oder Stabilisator des Mtb-Z-Rings. Die Bindung von FtsQ1-99 an die GTPase-Domäne von FtsZ steht im Gegensatz zu dessen Wechselwirkungen mit anderen Divisomproteinen, die alle über den ungeordneten C-Schwanz von FtsZ erfolgen, und hat Auswirkungen auf die Arzneimittelbindung und die Z-Ring-Bildung.

Es wird erwartet, dass die N-terminale zytoplasmatische Region von FtsQ, die die ersten 99 Reste umfasst, aufgrund ihres hohen Gehalts an geladenen Resten ungeordnet ist: Fast die Hälfte der Reste ist entweder positiv geladen (Arg und Lys, insgesamt 21) oder negativ geladen ( Asp und Glu, insgesamt 20) (Abb. 1a). Noch auffälliger ist, dass die positiven und negativen Ladungen getrennt sind, mit einer negativen Nettoladung von −14 für die ersten 44 Reste und einer positiven Nettoladung von +15 für die verbleibenden 55 Reste. In Übereinstimmung mit der Erwartung einer Störung ist das HSQC-Spektrum von FtsQ1-99 in Lösung mit einem engen Bereich der chemischen Protonenverschiebung (7, 8–8, 5 ppm) gut aufgelöst (Abb. 1b). Glu40 ist ein Ausreißer mit einer chemischen Protonenverschiebung von 9,1 ppm, was zumindest teilweise auf seine Position hinter einem Pro-Rest zurückzuführen ist.

a Die Aminosäuresequenz. Der helikale Bereich ist unterstrichen, die Ala-Reste darin sind grün; Saure und basische Reste werden in der gesamten Sequenz rot bzw. blau dargestellt. b 1H-15N-HSQC-Spektrum von einheitlich 13C-15N-markiertem FtsQ1-99 bei 370 μM, aufgenommen bei 800 MHz und 305 K in 20 mM Tris (pH 6,85) mit 50 mM NaCl. c Darstellung des helikalen Rades für die helikalen Kernreste 48–72. Saure, basische, Ala- und andere Rückstände werden jeweils in Rot, Blau, Grün und Grau angezeigt. Arg49 und Arg50 definieren einen 100°-Bogen, in den Ala53, Ala57, Ala60, Ala64 und Ala71 fallen.

Die vollständigen Zuordnungen für die chemischen Verschiebungen von N, HN, CO, Cα und Cβ im Grundgerüst sind in der Ergänzungstabelle 1 dargestellt. Die sekundären chemischen Verschiebungen von Cα und Cβ weisen eindeutig auf eine lange α-Helix hin, die im Mittelteil von FtsQ1-99 mit ΔδCα gebildet wird – ΔδCβ im Bereich von ~2–4 ppm für die Reste 50–71 (Abb. 2a). Die sekundären chemischen Verschiebungen der ersten 37 Reste und der letzten 24 Reste sind im Wesentlichen Null. Rückgrat-NH-Restdipolarkopplungen (RDCs), die durch Ausrichtung in gestreckten Polyacrylamidgelen gemessen werden, begrenzen diese α-Helix zwischen den Resten 46 und 74, die alle RDCs über ~ 2 Hz aufweisen (ergänzende Abbildung 1a). Einige der Peaks konnten aufgrund von Peaküberlappungen oder geringer Peakintensität nicht zugeordnet werden. Dieses Problem wird in den RDC-Experimenten noch verschlimmert, da die Datenanalyse vier separate Spektren erfordert und das Ausrichtungsmedium die Rotationskorrelationszeit erhöht, wodurch die Peaks verbreitert werden. Dennoch deuten die verschiedenen NMR-Experimente alle darauf hin, dass die helikale Region aus den Resten 46–74 besteht. Außerhalb dieser helikalen Region sind die RDCs nahezu null oder leicht negativ, was eine weitere Störung im N-Schwanz (Reste 1–45) und C-Schwanz (Reste 75–99) von FtsQ1-99 dokumentiert. Tatsächlich stimmen RDCs, die anhand eines Modells zurückgerechnet wurden, bei dem die Reste 46–74 eine α-Helix bildeten, gut mit den beobachteten Werten überein (ergänzende Abbildung 1b, c). Diese α-Helix ist mit 29 Resten ziemlich lang. Es zeichnet sich auch durch seine Zusammensetzung aus, mit 11 Arg-Resten, 10 Ala-Resten und nur 8 anderen Aminosäuren (einschließlich 3 Glu-Resten). Wir werden diese Helix daher als „Arg/Ala-reich“ bezeichnen. Für jeden Aminosäuretyp gibt es signifikante Unterschiede in den chemischen Verschiebungen von CO, Cα und Cβ zwischen helikalen und nichthelikalen Positionen. Als Referenz listen wir unten in der Ergänzungstabelle 2 die chemischen Verschiebungen von Ala, Arg und Glu auf, gemittelt über helikale und nichthelikale Positionen.

a Sekundäre chemische Verschiebungen (ΔδCα – ΔδCβ). Für Gly-Reste wird nur ΔδCα angezeigt. b–d R2, R1 und NOE. NMR-Daten sind schwarz dargestellt; MD-Ergebnisse werden in Rot angezeigt, wobei die quadratischen Mittelwertfehler (RMSEs) in den Legenden angegeben sind. Der helikale Kernbereich, der die Reste 48 bis 72 umfasst, ist schattiert. Horizontale Striche geben Durchschnittswerte innerhalb der helikalen Kernregion oder der nicht helikalen Region an (Reste 3–45 und 75–96).

Zusätzliche Unterstützung für die Schlussfolgerung, dass FtsQ1-99 in einem ansonsten ungeordneten Hintergrund eine α-Helix bildet, liefern NMR-Rückgratrelaxationsdaten (Abb. 2b – d). Die transversalen (R2) und longitudinalen (R1) Relaxationsraten sowie die heteronuklearen Overhauser-Effekte (NOEs) sind für die Reste 3–45 und 75–96 relativ einheitlich, mit Durchschnittswerten von 4,4 s−1, 1,3 s−1 und 0,2. bzw. die typisch für diejenigen sind, die für völlig ungeordnete Regionen berichtet werden18. Die helikale Region weist ein erhöhtes R2, ein erniedrigtes R1 und erhöhte NOEs auf, ähnlich den Relaxationsdaten, die für die C-terminale Domäne des Sendai-Virus-Nukleoproteins19 berichtet wurden, das ebenfalls eine α-Helix in einem ansonsten ungeordneten Hintergrund aufweist. Die durchschnittlichen R2-, R1- und NOE-Werte betragen 11,0 s−1, 1,2 s−1 bzw. 0,5 für den helikalen Kern (Reste 48–72).

Wir haben auch MD-Simulationen von FtsQ1-99 in Lösung durchgeführt. Die Reste 46–74, die in der Ausgangsstruktur als helikal modelliert wurden, bleiben in den Simulationen helikal (12 Wiederholungen, jeweils 1134 ns), mit Ausnahme einiger Ausfransungen an den Abdeckresten (ergänzende Abbildung 1d). Die N- und C-Schwänze bleiben ungeordnet, es bilden sich keine stabilen Sekundärstrukturen. Die Simulationen reproduzieren die sekundären chemischen Verschiebungen von Cα und Cβ sowie die Daten zur Rückgratrelaxation gut (Abb. 2).

Die Ladungstrennung zwischen dem N-Schwanz und dem Rest von FtsQ1-99 bietet Möglichkeiten für elektrostatische Wechselwirkungen. Um diese Möglichkeiten zu untersuchen, führten wir Experimente zur paramagnetischen Relaxationsverstärkung (PRE) durch, bei denen ein einzelner Cys-Rest an Thr24, Thr63 oder Ala87 eingeführt wurde, um eine MTSL-Spinmarkierung anzubringen (Abb. 3a). Diese Stellen wurden so ausgewählt, dass sie sich in der Nähe der Zentren der drei Abschnitte von FtsQ befinden, nämlich des N-Schwanzes, der Arg/Ala-reichen Helix und des C-Schwanzes. Wir haben uns auch auf Reste beschränkt, die Cys ähnlich sind. Die PRE-Daten der Spinmarkierungen an den Positionen 24 und 63 zeigen, dass sich der N-Schwanz über den helikalen Bereich faltet. Mit der Spinmarkierung an Position 24 erfahren die gesamte Arg/Ala-reiche Helix und einige Reste darüber hinaus (bis zu Rest 78) verminderte PREs, was auf die Nähe von Rest 24 zur helikalen Region im Konformationsensemble von FtsQ1-99 hinweist. Ebenso unterdrückt die Spinmarkierung an Position 63 PREs an den Resten 10–30. Die C-terminalen Reste 80–99 werden jedoch von keiner dieser Spinmarkierungen beeinflusst, was auf fehlende Wechselwirkungen zwischen dem C-Schwanz und dem N-Schwanz oder der Arg/Ala-reichen Helix hinweist. Zur Bestätigung ist anzumerken, dass die PRE-Effekte der Spinmarkierung an Position 87 vollständig auf den C-Schwanz beschränkt sind. Die Wechselwirkung zwischen der Arg/Ala-reichen Helix und dem sauren N-Schwanz ist wahrscheinlich wichtig für die Stabilität der Helix.

Vergleich experimenteller Daten und MD-Ergebnisse für a PRE-Werte mit Spinmarkierungen an den Resten 24, 63 und 87. b SAXS-Profile. Experimentelle Daten werden als graue Balken oder schwarze Punkte angezeigt; MD-Ergebnisse werden als grüne oder rote Kurven angezeigt, berechnet über alle MD-Konformationen oder unter Ausschluss derjenigen mit Kontakten zwischen den Resten 1–42 und 73–99.

Die MD-Simulationen liefern Details zu den Wechselwirkungen zwischen Resten in FtsQ1-99 (ergänzende Abbildung 2). Die Seitenketten-Seitenketten-Kontaktkarte zeigt umfangreiche elektrostatische Wechselwirkungen zwischen dem N-Schwanz und der Arg/Ala-reichen Helix. Die sauren Reste des N-Schwanzes bilden eine Brücke zwischen den Arg-Resten und sorgen so sowohl für eine Ladungsneutralisierung als auch für eine zusätzliche Stabilisierung der Helix (ergänzende Abbildung 2, oberer Einschub). Allerdings zeigt der N-Schwanz auch eine gewisse Tendenz, Salzbrücken mit dem C-Schwanz zu bilden (ergänzende Abbildung 2, unterer Einschub), was im Widerspruch zu den PRE-Daten steht und Einschränkungen des gegenwärtigen Kraftfelds für intrinsisch ungeordnete Proteine ​​aufzeigt. Wenn Konformationen mit Kontakten zwischen den Resten 1–42 und den Resten 73–99 ausgeschlossen werden, stimmen die aus den MD-Simulationen berechneten PRE-Ergebnisse gut mit den experimentellen Daten überein (Abb. 3a).

Wir haben das Konformationsensemble von FtsQ1-99 durch SAXS weiter charakterisiert (Abb. 3b). Das SAXS-Profil ist typisch für ein intrinsisch ungeordnetes Protein. Die Reproduktion durch die MD-Simulationen ist gut und wird weiter verbessert, wenn Konformationen mit Kontakten zwischen den Resten 1–42 und den Resten 73–99 ausgeschlossen werden.

Wie die Spiralradprojektion in Abb. 1c zeigt, bildet eine Teilmenge der Ala-Reste in der Arg/Ala-reichen Helix einen Grat entlang einer einzelnen Fläche der Helix. Aufgrund der amphipathischen Natur wird erwartet, dass diese Helix gut an saure Membranen bindet, die die innere Membran von Mtb5 nachahmen. Unser Pulldown-Assay zeigt tatsächlich, dass FtsQ1-99 zwar die neutralen POPC-Lipide nicht bindet, aber Vesikel bindet, wenn ein saures Lipid, POPG, in einer Menge von 40 % zugesetzt wird (Abb. 4a und ergänzende Abb. 3a). Wir haben die elektrostatische Natur dieser Bindung weiter bestätigt, indem wir den Test mit 8:2 POPG/POPC-Vesikeln bei steigenden Salzkonzentrationen durchgeführt haben. Eine starke Bindung tritt bei 50, 125 und 250 mM NaCl auf, aber der gebundene Anteil wird bei 500 mM NaCl deutlich reduziert und bei 1000 mM NaCl sogar noch weiter. Zirkulardichroismus-Spektren zeigen, dass der helikale Gehalt von FtsQ1-99 derselbe ist, egal ob in Lösung oder gebunden an 7:3 POPG/POPC-Vesikel (ergänzende Abbildung 3b, c).

ein SDS-PAGE-Gel, das den Anteil von FtsQ1-99 anzeigt, der frei von Lipidvesikeln bleibt. Bei den Gelproben handelte es sich um Überstände der angegebenen Mischungen, die unmittelbar nach der Ultrazentrifugenkondensation der Lipidvesikel gesammelt wurden. Alle Proben enthielten 320 μM FtsQ1-99 in 20 mM Tris (pH 6,85) in Gegenwart der angegebenen NaCl- und/oder Lipidvesikel mit einem endgültigen Protein-zu-Lipid-Verhältnis von 1:20. b Verhältnis der 1H-15N-HSQC-Peakintensitäten von 130 µM gleichmäßig 13C-15N-markiertem FtsQ1-99 in Gegenwart (I) und Abwesenheit (I0) von 7:3 POPG/POPC-Vesikeln (1:10 Protein-Lipid-Verhältnis). Aufgenommen bei 800 MHz und 305 K in 20 mM Tris-Puffer (pH 6,85) mit 50 mM NaCl.

Um die Membranbindung von FtsQ1-99 auf Restebene zu charakterisieren, haben wir das HSQC-Spektrum von FtsQ1-99 aufgenommen, das an 7:3 POPG/POPC-Vesikel gebunden ist (ergänzende Abbildung 4). Der helikale Bereich und die flankierenden Reste zeigen aufgrund der Membranbindung einen erheblichen Verlust der Peakintensität, wobei die Resonanzen für die Reste 50–80 nahezu verschwinden (Abb. 4b). Der Verlust der Peakintensität für den helikalen Bereich (Reste 46–74) wird erwartet. Der Verlust der Reste 21–45 und 75–84 könnte auf die Bewegungskopplung mit der Arg/Ala-reichen Helix zurückzuführen sein. Bei einer Reihe von Resten am C-Terminus kommt es ebenfalls zu einem Signalverlust, was auf eine zusätzliche Membranbindung hindeutet, die möglicherweise durch basische Reste in dieser Region, einschließlich K88, R96 und K99, vermittelt wird.

Das Lösungs-NMR-Experiment ist nützlich für die Identifizierung der helikalen Region von FtsQ für die Membranassoziation, aber der Verlust von Kreuzpeaks verhinderte eine weitere Charakterisierung von FtsQ-Membran-Wechselwirkungen. Daher wandten wir uns der Festkörper-NMR-Spektroskopie zu, wobei wir sowohl Magic-Angle-Spinning (MAS) als auch orientierte Proben verwendeten. Wenn einheitlich 13C-markiertes FtsQ1-99 an 7:3 POPG/POPC-Vesikel gebunden ist, erscheinen Reste, die dynamisch bleiben, in einem INEPT 13C-13C-Korrelationsspektrum, das an MAS-Proben aufgenommen wurde (Abb. 5a und ergänzende Abb. 5, blaue Kreuzpeaks). Die chemischen 13C-Verschiebungen dieser dynamischen Reste stimmen gut mit denen nichthelikaler Reste überein, die durch Lösungs-NMR bestimmt wurden. Beispielsweise liegen die Kreuzpeaks Alaβ-α, Argβ-α und Gluβ-α bei (51,83, 18,76), (55,34, 30,40) bzw. (55,93, 29,86) und liegen nahe am Durchschnitt (Cα, Cβ) chemische Verschiebungen (52,3 ± 0,1, 19,0 ± 0,1), (56,2 ± 0,4, 30,6 ± 0,1) und (56,1 ± 0,9, 30,0 ± 0,3) von Ala, Arg und Glu in nichthelikalen Regionen (Ergänzungstabelle 2). ). In einem Kreuzpolarisations-(CP)-13C-13C-Korrelationsspektrum, das über Reste berichtet, die in membrangebundenem FtsQ1-99 starr sind, gibt es weitaus weniger Kreuzpeaks (Abb. 5a, rote Kreuzpeaks; ergänzende Abb. 6). Die CP-Kreuzpeaks können mithilfe von Spektren, die an Proben aufgenommen wurden, bei denen nur Ala- und Arg-Reste mit 13C markiert waren, Ala, Arg und Glu zugeordnet werden (ergänzende Abbildung 7). Insbesondere bewegen sich die Alaβ-α-, Argβ-α- und Gluβ-α-CP-Kreuzpeaks zu (53,49, 18,10), (57,20, 30,10) und (58,00, 28,90) (Abb. 5a), was gut mit dem Durchschnitt übereinstimmt ( Cα, Cβ) chemische Verschiebungen (54,0 ± 0,2, 18,3 ± 0,1), (57,9 ± 0,2, 30,1 ± 0,2) und (58,1 ± 0,2, 29,4 ± 0,2) von Ala, Arg und Glu in der helikalen Region ( Ergänzungstabelle 2). In den CP-Spektren werden auch Kreuzpeaks benachbarter Kohlenstoffe weiter entlang der Arg-Seitenkette, dh Argγ-β und Argγ-δ, nachgewiesen (Abb. 5a und ergänzende Abb. 7). In der Carbonylkohlenstoffregion (Abb. 5b und ergänzende Abb. 6) sind die CP CO-Cα-Kreuzpeaks von Ala- und Arg-Resten sehr deutlich, wiederum bei chemischen Verschiebungen (179, 39, 53, 22) und (177, 71, 57, 83). Übereinstimmung mit den Gegenstücken dieser Aminosäuren im helikalen Bereich (179,7 ± 0,3, 54,0 ± 0,2) und (177,8 ± 0,4, 57,9 ± 0,2). Zuletzt untersuchten wir die Seitenkettenstickstoffatome starrer Arg-Reste, indem wir ein eindimensionales 15N-CP-MAS-Spektrum (ergänzende Abbildung 8) erfassten, das zusätzlich zu den Signalen der Rückgratstickstoffatome starke Signale von Nε und Nη zeigt. Kurz gesagt, die INEPT- und CP-Spektren zeigen, dass in membrangebundenem FtsQ1-99 nichthelikale Reste dynamisch sind, Reste in der Arg/Ala-reichen Helix jedoch starr, was bestätigt, dass diese Helix die Hauptregion ist, die an der Membranbindung beteiligt ist.

a Überlagerung der 13C-13C-Korrelationsspektren von INEPT (blau) und CP (rot). Erfasst bei 800 MHz mit einer Rotationsrate von 13 kHz und 7,5 ms bzw. 30 ms Mischzeiten für TOBSY-INEPT (298 K) und CP-PARIS (285 K). Die Proben enthielten FtsQ1-99 gebunden an 7:3 POPG/POPC bei einem Protein-zu-Lipid-Verhältnis von 1:20 in 20 mM Tris-Puffer (pH 6,85) mit 50 mM NaCl. Die ausgewählte Region hebt die einzigen signifikanten CP-PARIS-Seitenkettenresonanzen hervor, die den Ala-, Arg- und Glu-Resten zugeordnet sind. b Carbonylregion von CP-PARIS, die signifikante Cα-CO-Kreuzpeaks hervorhebt, die Ala- und Arg-Resten zugeordnet sind. Ein Arg-Cβ-CO-Kreuzpeak ist ebenfalls vorhanden. Die vollständigen Spektren sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 5 und 6.

Wir haben das membrangebundene FtsQ1-99 weiter durch Festkörper-NMR unter Verwendung einheitlich 15N-markierter orientierter Proben charakterisiert. Das PISEMA-Spektrum legt einen Neigungswinkel von 74 ° ± 4 ° für die Arg / Ala-reiche Helix in Bezug auf die Doppelschichtnormale nahe (ergänzende Abbildung 9a). Darüber hinaus dokumentiert der Nachweis (durch CP) anisotroper chemischer Verschiebungen der Arg-Seitenkette 15N bei 71 und 83 ppm (ergänzende Abbildung 9b) erneut die bedeutende Rolle von Arg-Resten aus der Arg / Ala-reichen Helix bei der Membranbindung.

Eine genauere Betrachtung der helikalen Radprojektion der Arg/Ala-reichen Helix (Abb. 1c) zeigt, dass der Ala-Kamm, der durch einen Ala-Rest aus jeder der sechs aufeinanderfolgenden Windungen gebildet wird (Ala53, Ala57, Ala60, Ala64, Ala68, Ala71), ist auf einen 100°-Bogen beschränkt, der von Arg49 und Arg50 begrenzt wird. Der hydrophobe Bogen wird durch die Cβ-, Cγ- und Cδ-Methylene der angrenzenden Arg-Reste (sowie durch die Cβ- und Cγ-Methylene von Gln67, die in die gleiche Richtung wie Arg49 projiziert werden) etwas erweitert. Die einzelne lange unpolare Seitenkette von Ile65 ist nicht Teil des hydrophoben Bogens. Das Ergebnis ist ein ungewöhnlich schmaler hydrophober Bogen, der nur von kurzen unpolaren Seitenketten oder Teilen davon bedeckt ist, was auf eine viel flachere Einbettung in den hydrophoben Kern der Membran als typische amphipathische Helices schließen lässt. Diese Erwartung wird durch MD-Simulationen bestätigt, bei denen die Arg/Ala-reiche Helix zunächst in unterschiedlichen Tiefen in POPG/POPC-Membranen vergraben wurde (ergänzende Abbildung 10a). Nach 200 ns Simulationen erreichte die Helix immer die gleiche geringe Tiefe (ergänzende Abbildung 10b). In nachfolgenden Simulationen mit einer Dauer von 1000 ns (16 Wiederholungen) bindet die Arg/Ala-reiche Helix stabil an die Membran (Abb. 6a).

a Verschiebungen der Seitenkettenspitzenatome von der durchschnittlichen Phosphorebene im oberen Blättchen. Die mittleren Ztip-Werte werden als verbundene Punkte angezeigt; Standardabweichungen, die über Konformationen berechnet wurden, die aus 16 Wiederholungssimulationen gesammelt wurden, werden als Band angezeigt. Die quadratische Mittelwertverschiebung der Phosphoratome aus der Durchschnittsebene wird durch ein Band angezeigt, das bei Ztip = 0 zentriert ist. b–d Seiten-, End- und Draufsicht der an die Membran gebundenen arg/Ala-reichen Helix mit einen Neigungswinkel von 79°. Arg, Ala, Glu und andere Reste liegen in den Farben Blau bzw. Cyan, Grün, Rot und Grau vor. PG- und PC-Kopfgruppen sowie Lipidacylketten werden in b und c als Oberflächen in Rosa, Grau bzw. Weiß angezeigt; PG- und PC-Kopfgruppen werden in d als Sticks angezeigt.

In Übereinstimmung mit den PISEMA-Daten weist die Helix in den MD-Simulationen einen Neigungswinkel von 79° ± 5° auf, wobei der C-Terminus stärker an der Membranschnittstelle vergraben ist als der N-Terminus (Abb. 6a, b). Auch im Einklang mit der starken Beteiligung von Arg-Resten aus der Arg/Ala-reichen Helix an der Membranbindung, die sowohl durch die MAS- als auch durch Festkörper-NMR-Daten orientierter Proben gezeigt wurde, interagieren die Arg-Seitenketten der gesamten Helix mit Lipidphosphaten (Abb. 6c). , D). Wenn der N-Terminus der Helix angehoben ist, greifen Arg49, Arg 50 und Arg52 nach unten, um Phosphate zu erhalten. Beim Abwärtsbewegen der Helix schnorcheln Arg56 und Arg61 von den gegenüberliegenden Seiten der Helix, während Arg69 und Arg70 direkt nach oben nach Phosphaten greifen. Die Seitenketten-Seitenketten-Kontaktkarte von membrangebundenem FtsQ1-99 zeigt, dass weitreichende Kontakte zwischen dem N-Schwanz und der Arg/Ala-reichen Helix nun so gut wie verschwinden (ergänzende Abbildung 11), weil die Arg-Reste in der Helix beschäftigen sich bereits mit Lipidphosphaten. Lokale Kontakte zwischen den letzten Resten des N-Schwanzes und den ersten Resten der Arg/Ala-reichen Helix werden immer noch gebildet, einschließlich Salzbrücken von Glu40 und Glu42 mit Arg 55 und von Arg45 mit Glu51, und können Bewegungskopplung vermitteln zwischen der Arg/Ala-reichen Helix und den flankierenden Resten.

Die oben dargestellten Festkörper-NMR- und MD-Simulationsdaten wurden unter Verwendung von Modellmembranen, dh POPG/POPC-Membranen im Molverhältnis 7:3, erhalten. Um zu zeigen, dass die Ergebnisse auf die native Membranumgebung anwendbar sind, haben wir auch MAS- und Festkörper-NMR-Studien mit orientierten Proben zur Bindung von FtsQ1-99 an Vesikel durchgeführt, die durch native Lipide von M. smegmatis gebildet werden, einem nichtpathogenen Modell von Mtb. Die unter Verwendung von Modell- und nativen Lipiden erhaltenen INEPT- und CP 13C-13C-Korrelationsspektren überlagern sich sehr gut (Ergänzende Abbildungen 5, 6b), ebenso wie die PISEMA-Spektren (Ergänzende Abbildungen 9c, d).

Da FtsZ und FtsQ zu den frühesten Proteinen gehören, die für das Divisom rekrutiert werden, haben wir uns gefragt, ob die N-terminale zytoplasmatische Region von Mtb FtsQ mit ihrer viel längeren Länge als das E. coli-Gegenstück an das wasserlösliche FtsZ binden kann. Unser Koelutionstest zeigt, dass FtsQ1-99 tatsächlich an Mtb FtsZ bindet (Abb. 7a, b). Genauer gesagt bindet es an die GTPase-Domäne (Reste 1–312) und nicht an den ungeordneten C-Schwanz (Reste 313–379) von FtsZ. Die Beteiligung der FtsZ-GTPase-Domäne an der Bindung mit einem anderen Divisomprotein ist ungewöhnlich, da es der C-Schwanz ist, der an FtsA, ZipA und SepF für die Membranverankerung von FtsZ11,12,13,16 und später an FtsW bindet Stadium der Zellteilung20,21.

eine SDS-PAGE von Aliquots, die durch individuelles Durchlaufen von His-markiertem FtsQ1-99 (His-FtsQ1-99) und unmarkiertem FtsZ in voller Länge oder seiner GTPase-Domäne (FtsZ-G) oder C-Schwanz (FtsZ-CT) einzeln durch einen Nickel gewonnen wurden Spalte. Abkürzungen sind: M, Molekulargewichtsmarker; FT, Durchfluss; E, Elution. Pfeilspitzen zeigen die Hauptpopulation an. b Entsprechende Ergebnisse, die beim Durchlaufen von Mischungen von His-FtsQ1-99 mit FtsZ, FtsZ-G oder FtsZ-CT durch eine Nickelsäule gesammelt wurden. Pfeilspitzen zeigen an, dass FtsZ und FtsZ-G sowie His-FtsQ1-99 in den Elutionsfraktionen gefunden werden, FtsZ-CT jedoch nur in der Durchflussfraktion. c Intensitätsverhältnis der Kreuzpeaks in den 1H-15N-HSQC-Spektren von 50 µM einheitlich 13C–15N markiertem FtsQ1-99 in Gegenwart (I) und Abwesenheit (I0) von 50 µM FtsZ. Aufgenommen bei 800 MHz und 298 K in 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) mit 25 mM NaCl.

Lösungs-NMR von FtsQ1-99 in Gegenwart von Mtb FtsZ zeigt die Arg/Ala-reiche Helix als zentrale Region für die Bindung an die FtsZ-GTPase-Domäne (Abb. 7c und ergänzende Abb. 12). Ähnlich wie die Änderungen der Peakintensitäten bei der Membranbindung (Abb. 4b) werden die Resonanzen der gesamten Arg/Ala-reichen Helix sowie einiger flankierender Reste von 38–79 bei der FtsZ-Bindung bis zur Erkennung verbreitert. Darüber hinaus kommt es auch bei Resten am C-Terminus zu einem gewissen Verlust der Peakintensität, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise zusätzliche Wechselwirkungen mit FtsZ eingehen. Wir haben durch Lösungs-NMR bestätigt, dass der FtsZ-C-Schwanz nicht mit FtsQ1-99 interagiert, da das HSQC-Spektrum des ersteren durch die Anwesenheit des letzteren nicht beeinflusst wird (ergänzende Abbildung 13). Die Lösungs-NMR-Daten zeigen somit, dass FtsQ1-99 hauptsächlich über die Arg/Ala-reiche Helix an die GTPase-Domäne von FtsZ bindet.

Wir verwendeten Computermodelle, um die wahrscheinliche Andockstelle für die FtsQ-Arg/Ala-reiche Helix zu identifizieren. Diese Helix ist sehr lang und zudem stark positiv geladen. Beide Merkmale werden durch die Spalte zwischen den beiden Subdomänen der FtsZ-GTPase-Domäne gut berücksichtigt (Abb. 8a und ergänzende Abb. 14). An der Basis dieser Spalte befindet sich die Kernhelix (genannt H7; Reste 175–20022), die mit 26 Resten in ihrer Länge nahezu der Arg/Ala-reichen Helix entspricht. Darüber hinaus ist die elektrostatische Oberfläche der GTPase-Domäne größtenteils negativ, und das negative elektrostatische Potential ist in der Spalte zwischen den Subdomänen am intensivsten. Als plausible Möglichkeit haben wir die Arg/Ala-reiche Helix in dieser Spalte parallel zur H7-Helix und mit einer Reihe von Arg-Resten an den Positionen 50, 61 und 69 innerhalb der Grenzfläche angedockt (Abb. 8b, linkes Feld). Zwischen den beiden Helices werden eine Reihe von Salzbrücken und Wasserstoffbrückenbindungen gebildet, darunter FtsQ Arg50 mit FtsZ Asp178, FtsQ Glu51 mit FtsZ Arg181, FtsQ Arg61 mit FtsZ Glu185 und Asn189 und FtsQ Arg69 mit FtsZ Thr199. Die Arg/Ala-reiche Helix bildet außerdem zwei zusätzliche Salzbrücken mit den Wänden der Spalte, nämlich zwischen FtsQ Arg55 und FtsZ Glu29 auf der einen Seite und zwischen FtsQ Arg75 und FtsZ Asp297 auf der gegenüberliegenden Seite (Abb. 8b, rechte Tafel). . Unabhängig von der genauen Andockstelle hält die direkte Bindung der FtsQ-Arg/Ala-reichen Helix an die FtsZ-GTPase-Domäne den Z-Ring in unmittelbarer Nähe zur inneren Membran.

a Die FtsQ-Helix ist an die GTPase-Domäne von FtsZ angedockt (Proteindatenbank (PDB)-Eintrag 1RQ222). Die FtsQ-Helix ist mit Arg, Ala, Glu und anderen Resten in Blau, Grün, Rot bzw. Grau dargestellt. Die FtsZ-GTPase-Domäne ist in Grau dargestellt, mit Ausnahme von Gelb für die H7-Helix an der Basis der Spalte zwischen den Subdomänen und zwei kurzen Segmenten am Eingang der Spalte. b Salzbrücken und Wasserstoffbrücken zwischen der FtsQ-Helix und der Inter-Subdomänen-Spalte der FtsZ-GTPase-Domäne. c Die FtsQ-Helix dockte an eine GTPase-Domäne in einem gebogenen FtsZ-Polymer an (PDB-Eintrag 4KWE26), frei von Kollisionen mit benachbarten GTPase-Domänen. d Die FtsQ-Helix dockte an eine GTPase-Domäne in einem geraden FtsZ-Polymer an (PDB-Eintrag 1W5A64) und kollidierte mit benachbarten GTPase-Domänen (siehe Einschub).

Durch die Kombination von Lösungs- und Festkörper-NMR, MD-Simulationen und anderen Techniken haben wir die Konformations- und dynamischen Eigenschaften der 99 Reste umfassenden N-terminalen zytoplasmatischen Region von FtsQ in Lösung und ihre Bindung an saure Membranen und an FtsZ gründlich charakterisiert. Das bemerkenswerteste Merkmal ist eine Arg/Ala-reiche α-Helix mit 29 Resten, die mit drei Partnern interagieren kann: N-terminale Reste in derselben Domäne, saure Membranen und die GTPase-Domäne von FtsZ. Letztere Eigenschaft macht FtsQ zu einem potenziellen Membrananker oder zumindest zu einem Stabilisator des Mtb-Z-Rings.

Während FtsQ auch in E. coli exprimiert wird, ist seine N-terminale zytoplasmatische Region nur etwa ein Viertel der Länge des Mtb-Homologs, was im Wesentlichen ausreicht, um den N-Terminus auf der zytoplasmatischen Seite der Membran zu halten und FtsZ nicht zu binden. Stattdessen wird die Membranverankerung in E. coli durch zwei andere Proteine ​​erreicht: FtsA und ZipA. Mtb verfügt über keine Homologen dieser Membrananker. Es scheint nun möglich, dass FtsQ ihre Rolle teilweise erfüllen kann. In einem zurückgezogenen Artikel wurde behauptet, dass FhaB als Membrananker des Z-Rings fungierte, indem es eine Brücke zwischen FtsQ und FtsZ23 bildete. Hier zeigen wir jedoch, dass FtsQ und FtsZ direkt aneinander binden. Ursprünglich wurde angenommen, dass FtsW ein Membrananker des Z-Rings ist20, später wurde jedoch festgestellt, dass die FtsZ-FtsW-Wechselwirkung die Biogenese der Zellwand reguliert21. Ein weiteres Protein, SepF, wurde bereits als Membrananker des Z-Rings in B. subtilis, C. glutamicum und Mtb11,14,15,16,17 charakterisiert. SepF ist ein wasserlösliches Protein, bindet sich jedoch über eine amphipathische Helix an seinem N-Terminus an Membranen und weist in der Mtb-Version auch arg-reiche Abschnitte im ungeordneten Linker vor der FtsZ-bindenden Kerndomäne auf17. Die zusätzlichen Membraninteraktionen durch den Mtb-SepF-Linker bringen den Z-Ring in unmittelbare Nähe zur Membran. Daher halten sowohl FtsQ als auch SepF, entweder zusammen oder unabhängig voneinander, den Mtb-Z-Ring nahe an der Membran. Die Membrannähe wiederum ermöglicht es dem Z-Ring, mit anderen Membranproteinen, einschließlich FtsW20,21 und CrgA24, in einem späteren Stadium der Zellteilung zu interagieren und diese so zu rekrutieren. FtsQ interagiert auch mit CrgA24, möglicherweise über deren Transmembranhelices; Die dreigliedrigen Wechselwirkungen zwischen FtsQ, CrgA und dem Z-Ring tragen dazu bei, die Integrität des späten Divisoms aufrechtzuerhalten.

Im Gegensatz zu anderen Divisomproteinen, die an FtsZ binden, bindet FtsQ an die GTPase-Domäne und nicht an den ungeordneten C-Schwanz von FtsZ. Die Bindung von FtsQ an die GTPase-Domäne beeinflusst möglicherweise die Arzneimittelbindung an dieselbe Domäne sowie andere Funktionen dieser Domäne und hat daher wichtige Konsequenzen. Insbesondere die C-terminale Hälfte der H7-Helix in der GTPase-Domäne kleidet eine Arzneimittelbindungsstelle25 aus. Wenn die FtsQ-Arg/Ala-reiche Helix tatsächlich wie hier modelliert an die Spalte zwischen den Subdomänen bindet (Abb. 8a), würden sich die Arzneimittelbindung und die FtsQ-Bindung gegenseitig beeinträchtigen. Dieses Szenario hätte Auswirkungen auf die Entwicklung von Medikamenten gegen Tuberkulose. Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass FtsQ auch an den C-Schwanz von FtsZ bindet, wenn es in hohen Konzentrationen im Z-Ring vorhanden ist. Kürzlich wurde vermutet, dass ZipA von E. coli sowohl mit dem C-Schwanz als auch mit der GTPase-Domäne interagiert13.

Ein weiteres wichtiges Problem, das durch die Tatsache, dass FtsQ an die GTPase-Domäne bindet, aufgeworfen wird, betrifft die Bildung des Z-Rings. Da der Z-Ring durch die Polymerisation der GTPase-Domäne gebildet wird, könnte die FtsQ-Bindung den Polymerisationsprozess beeinflussen. Es wurde erkannt, dass FtsZ bei der anfänglichen GTP-Bindung geradlinig polymerisiert, nach der GTP-Hydrolyse zu GDP jedoch die FtsZ-Polymere gekrümmt werden, wodurch die Bildung des Z-Rings erleichtert wird26. Interessanterweise interferiert die FtsQ-Arg/Ala-reiche Helix in der hier modellierten Bindungsstellung (Abb. 8a) nicht mit den GTPase-Domänen der benachbarten FtsZ-Monomere in gekrümmten Polymeren (Abb. 8c), stößt jedoch in geraden Polymeren auf Kollisionen (Abb . 8d). In diesem Fall würde FtsQ nicht nur den Z-Ring an der Membran verankern, sondern auch dessen Krümmung stabilisieren.

Mtb FtsQ1-99 mit einem N-terminalen His-Tag plus einer TEV-Spaltstelle wurde in E. coli BL21-Zellen exprimiert. Zur Expression von 13C-15N-markiertem Protein wurden Zellen in LB-Medium bei 310 K gezüchtet, bis die OD bei 600 nm 0,7 erreichte. Die Zellen wurden dann zur Isotopenmarkierung auf M9-Medium übertragen, das mit 1 g 15 N Ammoniumchlorid und 2 g 13 C-D-Glucose pro Liter Kultur ergänzt war. Die Kulturen wurden 2 Stunden lang bei 298 K inkubiert, bevor IPTG in einer Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben wurde. Die Proteinexpression wurde über Nacht bei 298 K fortgesetzt. Die Expression von unmarkiertem Protein erfolgte in LB-Medien. Die Zellen wurden in 20 mM Tris (pH 8,0) und 500 mM NaCl resuspendiert und dann unter Verwendung einer French Press lysiert. Zelltrümmer wurden durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × g und 281 K für 1–2 Stunden entfernt. Das geklärte Lysat wurde in eine mit Ni-NTA-Harz (Qiagen) vorbereitete Säule geladen. Das Harz wurde mit Lysepuffer gewaschen, der 60 mM Imidazol enthielt, und dann wurde das Protein mit 400 mM Imidazol eluiert. FtsQ1-99 enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und mit 1 mg TEV-Protease gemischt. Diese Probe wurde über Nacht bei 277 K gegen einen 20 mM Tris-Puffer (pH 8,0) mit 500 mM NaCl dialysiert. Um TEV-Protease zu entfernen, wurde die dialysierte Probe auf eine Ni-NTA-Säule geladen, wo FtsQ1-99 aus dem Durchfluss gesammelt und mit 20 mM Imidazol gewaschen wurde. Fraktionen mit FtsQ1-99 wurden entweder gegen einen 20 mM Tris-Puffer (pH 6,85) mit 50 mM NaCl oder einen 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 25 mM NaCl dialysiert. Proben, die eine zusätzliche Reinigung erforderten, wurden einem Anionenaustausch mithilfe einer Q-Sepharose-Säule unterzogen. FtsQ1-99-Proben wurden fixiert und entweder mit 20 mM Tris (pH 7,4) oder 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen und anschließend unter einem NaCl-Gradienten eluiert.

In ähnlicher Weise wurden Mtb FtsZ und seine globuläre Domäne (Reste 1–312; FtsZ-G) und sein C-Schwanz (Reste 313–379; FtsZ-CT) mit einem N-terminalen His-Tag plus einer TEV-Spaltungsstelle exprimiert. Die Expression und Reinigung der FtsZ-Konstrukte verlief auf ähnliche Weise wie bei FtsQ1-99, mit Ausnahme eines anderen Verfahrens während der Anionenaustauschchromatographie. Für FtsZ und FtsZ-G in voller Länge wurde ein Waschen mit 300 mM NaCl und eine Elution mit 500 mM NaCl verwendet, und für FtsZ-CT wurde kein Anionenaustausch durchgeführt. Die Proteinkonzentrationen wurden mithilfe des Bradford-Assays geschätzt.

Alle Lösungs-NMR-Experimente wurden bei 800 MHz unter Verwendung einer TCI-Kryosonde (1H/13C/15N) durchgeführt, die mit einer Avance II-Konsole ausgestattet war und mit TopSpin 2.1 betrieben wurde. Die sequentielle Rückgratzuordnung für FtsQ1-99 wurde mithilfe von 3D-HNCO-, HN(CA)CO-, HNCACB- und CACB(CO)NH-Experimenten bei 305 K in 20 mM Tris (pH 6,85) mit 50 mM NaCl und 7,5 % D2O durchgeführt. Die Daten wurden mit NMRPipe27 und Sparky28 verarbeitet und analysiert.

1H-15N J-Kopplungen und RDCs wurden unter Verwendung einer IPAP-WATERGATE HSQC-Sequenz29 gesammelt, wobei eine teilweise Ausrichtung unter Verwendung von 6 mm gestreckten Acrylamidgelen30 erreicht wurde. Die Proben enthielten 240 µM einheitlich 15N-markiertes FtsQ1-99 in 20 mM Tris-Puffer (pH 6,85) mit 50 mM NaCl. In-Phase- und Anti-Phase-Spektren wurden bei 800 MHz und 305 K sowohl unter isotropen als auch unter teilweise ausgerichteten Bedingungen gesammelt. RDC-Werte wurden mit NMRPipe und Sparky extrahiert.

Drei FtsQ1-99-Cysteinmutanten wurden für die MTSL-Spinmarkierung vorbereitet. Mutationen waren im N-Schwanz (T24C), der Arg/Ala-reichen α-Helix (T63C) und dem C-Schwanz (A87C) lokalisiert. Jeder einheitlich 15N-markierte Mutant wurde wie oben beschrieben gereinigt, jedoch in Gegenwart von 1 mM DTT. FtsQ1-99-Mutanten wurden 4 Stunden lang mit einem 20-fachen Überschuss an MTSL-Spinmarkierung (Santa Cruz Biotechnology) in 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) mit 25 mM NaCl und 0,5 mM DTT inkubiert. Den Proben wurde zusätzliches MTSL zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden gegen einen 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) mit 25 mM NaCl dialysiert, um ungebundenes MTSL zu entfernen. Für jede mit 50 μM MTSL markierte Probe wurden 2D-1H-15N-HSQC-Spektren gesammelt. Nach diesen Experimenten wurden diamagnetische Proben durch Zugabe von 2 mM Natriumascorbat (Sigma-Aldrich) und einstündiges Inkubieren bei Raumtemperatur hergestellt. 2D 1H-15N HSQC der reduzierten Proben wurden unter den gleichen Bedingungen wie zuvor gesammelt. PRE-Effekte wurden anhand des Signalintensitätsverhältnisses zwischen den paramagnetischen und diamagnetischen Proben (Ipara/Idia) geschätzt.

Die Bindung von FtsQ1-99 mit Lipiden wurde durch Sammeln von 2D-1H-15N-HSQC-Spektren von 130 μM einheitlich 13C-15N-markiertem FtsQ1-99 in Abwesenheit und Anwesenheit von POPG/POPC-Vesikeln (Molverhältnis 7:3) am Protein-zu bewertet -Lipidverhältnisse von 1:5 (0,65 mM Lipide) und 1:10 (1,30 mM Lipide). Die Proben wurden in 20 mM Tris (pH 6,85) mit 50 mM NaCl und 10 % D2O hergestellt. Die Daten wurden bei 800 MHz und 305 K gesammelt. In ähnlicher Weise wurde die Bindung an FtsZ durch Zugabe von 50 μM unmarkiertem FtsZ zur gleichen Menge einheitlich 13C-15N-markiertem FtsQ1-99 bewertet. Die Bindung wurde anhand der Änderungen der Peakintensität überwacht.

Darüber hinaus wurden mögliche Wechselwirkungen von FtsQ1-99 mit dem FtsZ-C-Schwanz durch Sammeln von 2D-1H-15N-HSQC-Spektren von 50 μM einheitlich 13C-15N markiertem FtsZ-C-Schwanz in Abwesenheit und Anwesenheit von 75 μM FtsQ1-99 bewertet. Es wurden ähnliche Bedingungen wie oben beschrieben verwendet.

Die Backbone 15N R1-Raten wurden mit 7 Verzögerungspunkten zwischen 50 ms und 1,0 s gemessen. Die kreuzkorrelierte Relaxation wurde mit einem WALTZ-Entkopplungsschema während der 15N-Relaxation unter Verwendung eines 1H-Feldes von 5000 Hz unterdrückt. 15N R1ρ-Raten wurden mit einem 1500-Hz-Spinlock-Feld unter Verwendung von Verzögerungen von 8 ms bis 200 ms gemessen. Die kreuzkorrelierte Relaxation wurde durch 1H 180°-Entkopplungsimpulse mit einer Feldstärke von 22,1 kHz alle 2 ms während der Spin-Lock-Periode unterdrückt. Die R1- und R1ρ-Raten wurden berechnet, indem die Intensitätsabfallprofile mit Sparky28 an eine Monoexponentie angepasst wurden. Die R2-Raten wurden aus den gemessenen R1ρ-Raten berechnet, wobei das effektive Feld und die Spin-Lock-Neigung für jede 15N-Resonanz sowie eine Korrektur des Beitrags der R1-Rate31 verwendet wurden. Zwischen den Experimenten wurde eine Entspannungsverzögerung von 4 Sekunden verwendet. 15N[1H]-NOEs wurden mit der Pulssequenz von Farrow et al.32 gemessen, mit einer Relaxationsverzögerung von 8 s zwischen den Experimenten.

15N-detektierte Magic Angle Spinning (MAS)-Spektren wurden bei 600 MHz mit einer speziell angefertigten Low-E-3,2-mm-Dreikanalsonde gesammelt, die mit einer Avance Neo-Konsole ausgestattet war, die mit der Topspin 4.0-Software betrieben wurde. Alle Proben wurden mit einer Bruker MAS III-Steuereinheit bei 8 kHz geschleudert. Die Referenzierung der chemischen 15N-Verschiebung wurde unter identischen Bedingungen unter Verwendung einer auf 39,3 ppm kalibrierten NH4Cl-Pulverprobe durchgeführt. Eindimensionale 15N-detektierte Spektren wurden bei einer kalibrierten Temperatur von 295 K mit einer 1H-15N-Kontaktzeit von 1 ms und einer 1H-Entkopplung gemessen, die unter Verwendung eines 75-kHz-HF-Feldes erreicht wurde, das mit einem SPINAL64-Schema angelegt wurde.

Zweidimensionale MAS-Messungen wurden bei 800 MHz mit einer speziell angefertigten Low-E-3,2-mm-Dreikanalsonde durchgeführt, die mit einer Avance III-HD-Konsole ausgestattet war und mit der Topspin 3.2-Software betrieben wurde. Alle Proben wurden mit einer Bruker MAS II-Steuereinheit bei 13 kHz geschleudert. Die Referenzierung der chemischen 13C-Verschiebung wurde unter identischen Bedingungen durchgeführt, wobei der Carbonylkohlenstoff einer kristallinen Glycinprobe auf 178,4 ppm eingestellt wurde. Die Spektren des 13C-13C-Phase-Altered-Recoupling-Bestrahlungsschemas (PARIS)33 wurden bei einer kalibrierten Temperatur von 285 K mit einer 1H-13C-Kontaktzeit von 700 µs und einer 13C-13C-Mischperiode von 30 ms gemessen. Die 1H-Entkopplung wurde mit einem 100-kHz-HF-Feld erreicht, das mit einem SPINAL64-Schema angelegt wurde. 13C-13C Total Through-Bond-Correlation Spectroscopy (TOBSY)-Spektren34,35 wurden bei einer kalibrierten Temperatur von 298 K mit einer Mischperiode von 7,5 ms gesammelt.

Zur Herstellung mechanisch orientierter Proben wurden POPG- und POPC-Pulver im Molverhältnis 7:3 eingewogen und in 2:1 Chloroform/Methanol gelöst. Diese Lösung wurde unter einem Stickstoffstrom in einem Glasrundkolben getrocknet. Restliches organisches Lösungsmittel wurde durch Lyophilisierung über Nacht entfernt. Lipidfilme wurden in 20 mM Tris (pH 6,85) und 50 mM NaCl rehydratisiert und im Bad mit Ultraschall behandelt, um kleine unilamellare Vesikel zu erzeugen. In passendem Puffer suspendiertes FtsQ1-99 wurde zur Vesikellösung gegeben und 1–2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Proteoliposomen wurden auf ca. 40 Objektträger verteilt und in einer verschlossenen Box trocknen gelassen. Vor dem Stapeln wurde auf jeden Objektträger ein Tropfen 1 µl Wasser aufgetragen und anschließend über Nacht bei 97 % relativer Luftfeuchtigkeit gelagert. Der Stapel Glasobjektträger wurde dann in ein rechteckiges Glasrohr eingeführt und mit Wachs und Parafilm versiegelt.

Festkörper-NMR-Messungen mit orientierten Proben wurden bei 800 MHz unter Verwendung einer speziell angefertigten statischen 1H-XY-Flachspulensonde mit niedrigem E-Wert und einer Avance I-Konsole durchgeführt, die mit Topspin 2.1 betrieben wurde. PISEMA-Spektren wurden bei 298 K mit einer „Magic Sandwich“-Pulssequenz36 aufgenommen. Die HF-Felder für 1H- und 15N-Kanäle während der Kreuzpolarisations- (CP) und SAMMY-Blöcke betrugen 50 kHz mit einer CP-Kontaktzeit von 0,7 ms. Die 1H-Entkopplung wurde bei 30 kHz während der direkten Dimensionsentwicklung mit einer Recyclingverzögerung von 4 s angewendet. Die chemischen 15N-Verschiebungen wurden auf einen Gramicidin-Standard bezogen und die dipolaren Skalierungsfaktoren wurden von Cui et al.37 übernommen.

Native Lipide von M. smegmatis wurden mithilfe eines Saccharose-Dichtegradienten und der Folch-Lipidreinigung38,39 gereinigt. Kurz gesagt, Mykobakterienzellen wurden zunächst durch French Press lysiert, gefolgt von einer Hochdruckhomogenisierung mit einem Emulsiflex C5-System. Das Lysat wurde zunächst bei 10.000 × g zentrifugiert, um Zellwandbestandteile zu entfernen, dann bei 27.000 × g, um große Zelltrümmer zu entfernen, und schließlich bei 100.000 × g, um die Plasmamembran zu kondensieren. Die Membranfraktion wurde dann unter Verwendung eines Saccharose-Dichtegradienten bei 100.000 × g gereinigt, woraufhin die Lipide unter Verwendung einer Folch-Methode weiter von restlichen Proteinkomponenten gereinigt wurden. Auf diese Weise getrennte Lipide wurden in einer 2:1 (v/v) Chloroform-Methanol-Mischung suspendiert und anschließend unter einem N2-Gasstrom in einem Glasrundkolben getrocknet, um Lipidfilme zu bilden.

100 Modelle wurden mit XPLOR-NIH Version 3.040 und den vorhergesagten Diederbeschränkungen von RDC und TALOS+41 generiert. Jede simulierte Glühbahn folgte einem linearen Temperaturanstieg von 1000 K auf 10 K in 10-K-Schritten. Die Kraftkonstanten für Diederwinkelbeschränkungen wurden konstant bei 300 kcal mol−1 rad−2 gehalten. Die Kraftkonstanten für RDC-Beschränkungen wurden von 0,001 kcal mol−1 Hz−2 auf 0,08 kcal mol−1 Hz−2 erhöht. Acht Modelle mit dem niedrigsten Energieverbrauch wurden eingespart.

SAXS-Daten für FtsQ1-99 wurden an der Advanced Photon Source des Argonne National Laboratory mithilfe der Strahllinie DND-CAT 5ID-D gesammelt. Die Daten wurden an zwei FtsQ1-99-Proben gesammelt, eine mit 0,75 mg/ml und die andere mit 1,5 mg/ml. Diese Proben wurden in 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) mit 25 mM NaCl hergestellt. Die Daten dieser beiden Proben wurden mit dem ATSAS-Softwarepaket zusammengeführt.

Die Lipidbindung wurde durch Mischen von 320 µM FtsQ1-99 mit Lipidvesikeln (6,58 mM Lipide; Protein-Lipid-Verhältnis ~1:20) in 20 mM Tris (pH 6,85) mit 50 mM NaCl getestet. Nach ca. 2 Stunden Inkubation wurden die Gemische 4–12 Stunden lang bei 281 K einer Zentrifugation mit 100.000 × U/min unterzogen, um Vesikel zu kondensieren. Unmittelbar danach wurden überstehende Aliquots direkt vom Zentrifugenrotor gesammelt, um eine erneute Kondensation zu vermeiden. Die Proben wurden dann mittels SDS-PAGE-Elektrophorese sichtbar gemacht.

Die FtsZ-Bindung wurde durch Mischen von 50 µg His-markiertem FtsQ1-99 mit 50 µg FtsZ, FtsZ-G oder FtsZ-CT in 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) mit 25 mM NaCl in einem Endvolumen von 500 µL getestet. Diese Proben wurden auf eine Ni-NTA-Säule (100 µL) geladen und der Durchfluss wurde gesammelt. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer, der 20 mM Imidazol enthielt, wurde His-FtsQ1-99 mit Puffer, der 400 mM Imidazol enthielt, eluiert. Jedes Protein wurde einzeln als Negativkontrolle getestet. Aliquots von Durchfluss und Elution wurden mittels SDS-PAGE ausgewertet.

MD-Simulationen von FtsQ1-99 in Lösung ähnelten früheren Studien an ungeordneten Proteinen18,42, wobei das AMBERff14SB-Kraftfeld43 für Proteine ​​und das TIP4PD-Wassermodell44 verwendet wurden. Die Ausgangsstruktur für die Simulationen war das von XPLOR-NIH wie beschrieben berechnete Modell mit der niedrigsten Energie über. Nach der Solvatisierung wurden Na+ und Cl− hinzugefügt, um das System zu neutralisieren und eine Salzkonzentration von 50 mM zu erreichen, was zu Systemabmessungen von 126 Å × 126 Å × 179 Å und insgesamt 358.572 Atomen führte. Das System wurde energieminimiert (2000 Schritte des steilsten Abstiegs und 3000 Schritte des konjugierten Gradienten) und bei konstantem Volumen über 100 ps bei einem Zeitschritt von 1 fs im Sander auf 300 K erhitzt. Die Simulationen wurden dann auf GPUs in 12 Replikaten mit pmemd.cuda45 bei konstanter Temperatur (300 K) und konstantem Druck (1 atm) für 1134 ns bei einem Zeitschritt von 2 fs fortgesetzt. Die Temperatur wurde durch den Langevin-Thermostat46 mit einer Dämpfungskonstante von 3,0 ps−1 reguliert; Der Druck wurde durch den Berendsen-Barostat47 mit einer Relaxationszeit von 0,5 ps reguliert. Bindungslängen, an denen Wasserstoffatome beteiligt sind, wurden mit SHAKE48 eingeschränkt. Elektrostatische Wechselwirkungen mit großer Reichweite wurden mit der Partikelnetz-Ewald-Methode49 mit einem nichtgebundenen Grenzabstand von 10 Å behandelt. Die letzten 1000 ns mit gespeicherten Schnappschüssen in 20-ps-Intervallen wurden zur Analyse verwendet.

MD-Simulationen von an Membranen gebundenem FtsQ1-99 ähnelten einer früheren Studie50; Details, die mit denen in der Lösung identisch sind, werden nicht wiederholt. Das Kraftfeld für Lipide war Lipid1751. Die ursprüngliche Struktur von FtsQ1-99 wurde aus den Simulationen in Lösung erhalten, wobei die Arg/Ala-reiche Helix mithilfe des CHARMM-GUI-Webservers in drei verschiedenen Tiefen in Membranen eingebettet wurde52. Die Membranen bestanden aus 210 POPG-Lipiden und 90 POPC-Lipiden pro Blättchen. Die Systemabmessungen betrugen 146 Å × 146 Å × 159 Å, mit insgesamt 426.384 bis 446.918 Atomen. Jedes System wurde energieminimiert (10.000 Schritte des konjugierten Gradienten) und in NAMD 2.1253 nach einem sechsstufigen CHARMM-GUI-Protokoll äquilibriert52. Dieses Protokoll bestand aus drei Schritten von jeweils 25 ps bei einem Zeitschritt von 1 fs und drei Schritten von jeweils 100 ps bei einem Zeitschritt von 2 fs. Die ersten beiden Schritte erfolgten bei konstanter Temperatur und konstantem Volumen, während die restlichen vier Schritte bei konstanter Temperatur und konstantem Druck stattfanden; Beschränkungen des Proteins und der Lipide wurden in den sechs Schritten schrittweise aufgehoben. Die Temperatur wurde durch den Langevin-Thermostat46 mit einer Dämpfungskonstante von 1,0 ps−1 auf 300 K gehalten, und der Druck wurde durch den Langevin-Kolben54 mit einer Schwingungsdauer von 50 fs und einer Abklingzeit von 25 fs auf 1 atm gehalten. Der nicht gebundene Grenzabstand betrug 12 Å, wobei die Kraftumschaltung bei 10 Å erfolgte. Die Simulationen jedes Systems wurden auf GPUs in vier Replikaten für 200 ns bei konstanter Temperatur und konstantem Druck fortgesetzt. Der nicht gebundene Grenzabstand betrug 11 Å, wobei die Kraftumschaltung bei 9 Å lag. In xy-Richtung wurde eine semiisotrope Skalierung angewendet, um die Gesamtform des Systems beizubehalten. Am Ende dieser Simulationen konvergierten die Systeme auf die gleiche Versenkungstiefe (ergänzende Abbildung 10b). Sechzehn Wiederholungssimulationen wurden weitere 1000 ns lang fortgesetzt. Diese Simulationsdaten wurden zuvor verwendet, um einen Prädiktor für Membranassoziationsneigungen zu trainieren und zu testen55.

Datenanalysen folgten früheren Arbeiten18,42,50. Cpptraj56 von Ambertools19 wurde zur Berechnung von Sekundärstrukturen verwendet (Implementierung des DSSP-Algorithmus57). Sekundärstrukturen wurden weiter modifiziert, um die Bildung von Polyprolin II (PPII)-Abschnitten einzubeziehen, wenn drei oder mehr aufeinanderfolgende Reste als Knäuel klassifiziert wurden und in die PPII-Region der Ramachandran-Karte fielen. Um Kontaktkarten zu berechnen, wurden MD-Trajektoriendateien mit mdtraj58 geladen und Abstände zwischen den schweren Atomen der Seitenkette (mit Ausnahme derjenigen aus demselben Rest) berechnet. Ein Kontakt wurde definiert, wenn sich zwei schwere Atome innerhalb von 3,5 Å befanden. Die Anzahl der Snapshots, in denen ein Kontakt zustande kam, geteilt durch die Gesamtzahl der Snapshots ergab die Kontakthäufigkeit. Um die NMR-Relaxationseigenschaften zu berechnen, wurde die Zeitkorrelationsfunktion jedes Rückgrat-NH-Bindungsvektors zunächst an eine Summe von drei Exponentialfunktionen angepasst und die resultierende Fourier-Transformation in Standardformeln zur Berechnung von R2, R1 und NOE verwendet. Um den Einfluss des Langevin-Thermostats auf die dynamischen Eigenschaften zu kompensieren, wurden die Zeitkonstanten aus der Drei-Exponential-Anpassung mit vorgegebenen Faktoren skaliert59.

Ztip-Abstände wurden ebenfalls mit cpptraj berechnet. Für jeden Rest wurde Ztip als zwischen dem am weitesten entlang der Seitenkette liegenden Kohlenstoffatom und der durchschnittlichen Phosphorebene des oberen Blättchens definiert. Um den Neigungswinkel des Helixkerns zu definieren, wurden die Geometriezentren von drei Cα-Atomen (Reste 49–51) in der ersten Windung und der letzten Windung (Reste 70–72) berechnet; Der Winkel zwischen der Verbindungslinie dieser beiden Punkte und dem Normalenvektor der durchschnittlichen Phosphorebene war der Neigungswinkel.

Die folgenden Eigenschaften wurden anhand jedes Zehntels der gespeicherten Snapshots berechnet. Zur Berechnung der chemischen Verschiebungen wurde SHIFTX260 verwendet. Die zur Berechnung der sekundären chemischen Verschiebungen verwendeten chemischen Verschiebungen mit Zufallsspulen stammen von POTENCI61. Zur Berechnung der PREs wurde DEER-PREdict62 verwendet. FoXS63 wurde zur Berechnung des SAXS-Profils verwendet, wobei das berechnete Ergebnis für jeden Schnappschuss skaliert wurde, um Abweichungen von den experimentellen Daten zu minimieren.

Experimentelle Daten (z. B. NMR, CD und Pulldown) wurden nach gängigen Praktiken erfasst. Molekulardynamiksimulationen wurden für 12 Replikate in Lösung und für 16 Replikate an der Membranoberfläche durchgeführt. Die Konvergenz der MD-Simulationen wurde validiert, indem gezeigt wurde, dass die in 250-ns-Blöcken entlang der Trajektorien berechneten Ergebnisse innerhalb einer Standardabweichung vom Mittelwert liegen. Der Mittelwert und die Standardabweichung wurden mithilfe der Replikatsimulationen berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Datendateien) enthalten. Die chemischen Verschiebungen und Relaxationsdaten von FtsQ1-99 in Lösung wurden in der Biomolecular Magnetic Resonance Database (https://bmrb.io/) unter dem Zugangscode 51860 hinterlegt. Die SAXS-Daten wurden in der Small Angle Scattering Biological Data Bank hinterlegt ( https://www.sasbdb.org/) unter dem Zugangscode SASDRA6. Die Quelldaten für alle in den Abbildungen dargestellten Diagramme werden als Ergänzungsdaten 1 hochgeladen.

Datenanalyseverfahren wurden unter Materialien und Methoden beschrieben. Alle verwendeten Computerprogramme wurden zitiert und waren öffentlich zugänglich. Die Eingabedateien für MD-Simulationen in Lösung und an der Membranoberfläche sowie die Anfangs- und Endkoordinatendateien werden als Ergänzungsdaten 2–7 hochgeladen.

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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants AI119187, GM122698 und GM118091 unterstützt. Alle NMR-Experimente wurden im National High Magnetic Field Laboratory mit Unterstützung der NSF-Kooperationsvereinbarung Nr. 1644779 und dem Bundesstaat Florida durchgeführt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sean T. Smrt, Cristian A. Escobar.

National High Magnetic Field Laboratory, Tallahassee, FL, 32310, USA

Sean T. Smrt, Cristian A. Escobar und Timothy A. Cross

Abteilung für Chemie und Biochemie, Florida State University, Tallahassee, FL, 32306, USA

Sean T. Smrt und Timothy A. Cross

Institut für Molekulare Biophysik, Florida State University, Tallahassee, FL, 32306, USA

Cristian A. Escobar und Timothy A. Cross

Fakultät für Chemie, University of Illinois Chicago, Chicago, IL, 60607, USA

Souvik Dey & Huan-Xiang Zhou

Fachbereich Physik, University of Illinois Chicago, Chicago, IL, 60607, USA

Huan-Xiang Zhou

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TAC und H.-XZ haben die Forschung entworfen; STS und CAE, SD führten die Forschung durch und analysierten die Daten; TAC und H.-XZ haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Timothy A. Cross oder Huan-Xiang Zhou.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Bhargy Sharma und Jingyuan Li für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Smrt, ST, Escobar, CA, Dey, S. et al. Eine Arg/Ala-reiche Helix im N-terminalen Bereich von M. tuberculosis FtsQ ist ein potenzieller Membrananker des Z-Rings. Commun Biol 6, 311 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04686-5

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Eingegangen: 07. Dezember 2022

Angenommen: 09. März 2023

Veröffentlicht: 23. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04686-5

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