Strukturen des TMC

Nature Band 610, Seiten 796–803 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Der erste Schritt im sensorischen Übertragungsweg, der dem Hören und dem Gleichgewicht bei Säugetieren zugrunde liegt, umfasst die Umwandlung von Kraft in die Aktivierung eines mechanosensorischen Übertragungskanals1. Trotz der tiefgreifenden sozioökonomischen Auswirkungen von Hörstörungen und der grundlegenden biologischen Bedeutung des Verständnisses der mechanosensorischen Transduktion sind Zusammensetzung, Struktur und Mechanismus des mechanosensorischen Transduktionskomplexes bisher nur unzureichend charakterisiert. Hier berichten wir über die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur des aus Caenorhabditis elegans isolierten mechanosensorischen Transduktionskomplexes des nativen transmembranen kanalähnlichen Proteins 1 (TMC-1). Der zweifach symmetrische Komplex besteht aus jeweils zwei Kopien der porenbildenden TMC-1-Untereinheit, dem Calcium-bindenden Protein CALM-1 und dem transmembranen Innenohrprotein TMIE. CALM-1 stellt umfangreiche Kontakte mit der zytoplasmatischen Seite der TMC-1-Untereinheiten her, während sich die Single-Pass-TMIE-Untereinheiten an der Peripherie des Komplexes befinden und wie die Griffe einer Ziehharmonika positioniert sind. Eine Untergruppe von Komplexen umfasst zusätzlich ein einzelnes Arrestin-ähnliches Protein, das Arrestin-Domänenprotein (ARRD-6), das an eine CALM-1-Untereinheit gebunden ist. Einzelpartikelrekonstruktionen und Molekulardynamiksimulationen zeigen, wie der mechanosensorische Transduktionskomplex die Membrandoppelschicht verformt, und legen eine entscheidende Rolle für Lipid-Protein-Wechselwirkungen im Mechanismus nahe, durch den mechanische Kraft auf die Ionenkanalsteuerung übertragen wird.

Das Hörsystem verfügt über eine bemerkenswerte Fähigkeit, ein breites Spektrum akustischer Wellenfrequenzen und -amplituden zu erkennen, indem es mechanische Schwingungsenergie in Membranpotentialdepolarisation umwandelt und anschließend Signale in höheren Gehirnzentren verarbeitet, wodurch die Wahrnehmung von Schall ermöglicht wird1. Funktionsstörungen des Hörsystems aufgrund von Verletzungen, Umwelteinflüssen oder genetischen Mutationen sind mit altersbedingtem Hörverlust verbunden. Weltweit sind mehr als 460 Millionen Menschen von Schwerhörigkeit und Taubheit betroffen, wobei die jährlichen Kosten für unbehandelten Hörverlust auf 750 bis 790 Milliarden US-Dollar geschätzt werden. Die Eingabe in das auditorische und das damit eng verbundene Vestibularsystem wird, wie auch bei anderen sensorischen Systemen, durch Rezeptoraktivierung an peripheren Neuronen initiiert. Trotz intensiver Forschung über mehrere Jahrzehnte hinweg sind die molekulare Zusammensetzung, Struktur und der Mechanismus des mechanosensorischen Transduktionskomplexes (MT), dem Rezeptor für die mechanosensorische Transduktion, noch immer ungeklärt.

Mehrere Forschungslinien aus Studien an Menschen und Modellorganismen wie Mäusen, Zebrafischen und C. elegans haben Licht auf die Proteine ​​geworfen, die den MT-Komplex bilden, und auf ihre wahrscheinliche Rolle bei seiner Funktion2. Dazu gehören die Tip-Link-Proteine ​​Protocadherin-15 und Cadherin-23, die in Haarzellen die von der Stereozilienverschiebung herrührende Kraft auf die Öffnung der Ionenkanalkomponente des MT-Komplexes übertragen3,4. TMC-1 und TMC-2 sind die wahrscheinlich porenbildenden Untereinheiten des MT-Komplexes, Kandidaten, die erstmals in humangenetischen Studien5 bekannt wurden und in jüngerer Zeit durch biophysikalische und biochemische Untersuchungen6,7,8 als Ionenleitungsweg an Bedeutung gewonnen haben . Zusätzliche Proteine, von denen einige Hilfsuntereinheiten sein können, wurden entweder mit der Biogenese oder Funktion des MT-Komplexes in Verbindung gebracht und umfassen TMIE9,10,11, Ca2+ und Integrin-bindendes Protein 212,13,14 (CIB2), Lipom-HMGIC-Fusion- wie Protein 515,16,17 (LHFPL5), Transmembran-O-Methyltransferase18,19 (TOMT) und möglicherweise Ankyrin13.

Die Isolierung des MT-Komplexes aus Wirbeltierquellen oder die Herstellung eines funktionellen Komplexes über rekombinante Methoden haben sich bisher als erfolglos erwiesen. Die komplexe Reinigung aus einheimischen Quellen stellt aufgrund der geringen Anzahl an Komplexen pro Tier, die auf etwa 3 × 106 pro Säugetier-Cochlea20 geschätzt wird, eine besondere Herausforderung dar, eine kleine Zahl im Vergleich zur Anzahl der Photorezeptoren im visuellen System, die etwa 4 × 1014 pro Auge beträgt in Maus21. Um die Herausforderungen bei der Verfügbarkeit von MT-Komplexen bei Wirbeltieren zu meistern, haben wir uns an C. elegans gewandt, ein Tier, das einen MT-Komplex zur Wahrnehmung taktiler Reize nutzt. Wir stellen zunächst fest, dass C. elegans zusätzlich zu einem CIB2-Homolog namens CALM-1 und TMIE13 wichtige Komponenten des Wirbeltier-MT-Komplexes exprimiert, einschließlich der TMC-1- und TMC-2-Proteine. Zweitens zeigen Würmer, die nicht über TMC-1 verfügen, eine abgeschwächte Reaktion auf leichte Berührungen13. Drittens ist es trotz der begrenzten Expression der TMC-Proteine ​​in C. elegans möglich, eine ausreichende Anzahl von Würmern zu züchten, um genügend Komplex für Strukturstudien zu isolieren. Wir haben daher den tmc-1-Locus von C. elegans modifiziert, indem wir einen fluoreszierenden Reporter und einen Affinitätstag eingefügt haben, wodurch wir die Expression mittels Ganztierfluoreszenz und Fluoreszenzdetektions-Größenausschlusschromatographie (FSEC)22 überwachen und den TMC isolieren konnten -1-Komplex durch Affinitätschromatographie. Zusammen mit rechnerischen Studien haben wir die Zusammensetzung, Architektur und Membranwechselwirkungen des Komplexes aufgeklärt und Mechanismen für die Öffnung der Ionenkanalpore sowohl durch direkte Proteinwechselwirkungen als auch über die Membrandoppelschicht vorgeschlagen.

Wir haben eine transgene Knock-in-Wurmlinie erzeugt, in der eine für mVenus kodierende Nukleinsäuresequenz mit einem 3×Flag-Tag am 3'-Ende der TMC-1-Kodiersequenz unmittelbar vor dem Stoppcodon eingefügt wurde (ergänzende Abbildung 1). Wir haben die manipulierte, homozygote Wurmlinie (tmc-1::mVenus) durch spektrale konfokale Bildgebung charakterisiert und dabei mVenus-Fluoreszenz in den Kopf- und Schwanzneuronen, der Körperwand und den Vulvamuskeln festgestellt (Extended Data Abb. 1a), was mit früheren Studien übereinstimmt, die die Expression belegen von TMC-1 in diesen Zellen23. Der TMC-1-Komplex wurde aus den transgenen tmc-1::mVenus-Würmern durch Affinitätschromatographie isoliert und durch Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter gereinigt (Extended Data, Abb. 1b). Das von SEC geschätzte Molekulargewicht des TMC-1-Komplexes beträgt ~780 kDa, was darauf hindeutet, dass der Komplex mehrere TMC-1-Protomere und möglicherweise zusätzliche Hilfsuntereinheiten enthält.

Um den oligomeren Zustand des Komplexes unabhängig abzufragen, führten wir Einzelmolekül-Pulldown-Experimente (SiMPull)24 durch. Photobleichungsspuren eingefangener TMC-1-Komplexe zeigen, dass etwa 62 % der mVenus-Fluorophore in zwei Schritten, 37 % in einem Schritt und 1 % in drei Schritten gebleicht wurden (Extended Data Abb. 1c – e), was mit der Schlussfolgerung übereinstimmt dass es im TMC-1-Komplex zwei Kopien der TMC-1-Untereinheit gibt. Die Diskrepanz zwischen der vorhergesagten Molekülmasse eines C. elegans TMC-1-Dimers von etwa 300 kDa und der von SEC geschätzten des Komplexes deutet auf das Vorhandensein von Hilfsproteinen hin. Da in Würmern13 und Wirbeltieren2 mehrere TMC-1-Bindungspartner identifiziert wurden, untersuchten wir als nächstes die Zusammensetzung des TMC-1-Komplexes mittels Massenspektrometrie.

Die massenspektrometrische Analyse des TMC-1-Komplexes identifizierte drei Proteine, die gemeinsam mit TMC-1 gereinigt wurden: (1) CALM-1, ein Ortholog von Säugetier-CIB2; (2) ein Ortholog von TMIE; (3) ARRD-6, ein Ortholog der Familie der Arrestindomänen enthaltenden Säugetierproteine ​​(Extended Data Abb. 2). Alle drei Proteine ​​wurden in der aus transgenen Würmern gereinigten TMC-1-Probe gefunden, jedoch nicht in der aus Wildtyp-Würmern hergestellten Kontrollprobe, was mit ihrer spezifischen Assoziation mit dem TMC-1-Komplex übereinstimmt. Die Säugetierorthologen CIB2 und TMIE sind wahrscheinlich Bestandteile des Säugetier-MT-Komplexes; Sie lokalisieren an Stereozilien9,10,11,12,14,25 und binden in Pulldown-Assays an exogen exprimierte TMC-1-Fragmente10. Im Gegensatz dazu wurde ARRD-6 weder als Bestandteil des TMC-1-Komplexes von C. elegans noch von Wirbeltieren beschrieben. Trotz wiederholter Bemühungen fanden wir keine Hinweise auf das Vorhandensein von UNC-44, dem Wurm-Ortholog von Säugetier-Ankyrin, im Gegensatz zu einem früheren Bericht, dass UNC-44 einen Komplex mit CALM-1 bildet und für die TMC-1-vermittelte Mechanotransduktion notwendig ist. und ist die „Torfeder“ des TMC-1-Komplexes13, was die Frage nach der Rolle von UNC-44 und im weiteren Sinne von Ankyrin in der Struktur und Funktion von MT-Komplexen in Würmern bzw. Wirbeltieren aufwirft.

Um die Architektur und Anordnung der Untereinheiten im TMC-1-Komplex aufzuklären, führten wir Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) durch. TMC-1 wird in C. elegans in geringem Maße exprimiert und wir benötigten etwa 6 × 107 transgene Würmer, um etwa 50 ng des TMC-1-Komplexes für die Kryo-EM-Analyse zu erhalten. Der TMC-1-Komplex wurde auf 2 nm großen kohlenstoffbeschichteten Gittern sichtbar gemacht, die in Gegenwart von Amylamin einer Glimmentladung unterzogen wurden. Die Kryo-EM-Bildgebung zeigte eine nahezu ideale Partikelverteilung und wir sammelten einen Datensatz mit 26.055 Filmen. Die referenzfreie 3D-Klassifizierungsrekonstruktion zusammen mit Verfeinerungen führte zu drei genau definierten Klassen (Extended Data Abb. 3–5 und Extended Data Table 1). Zwei dieser Klassen repräsentieren den TMC-1-Komplex in unterschiedlichen Konformationszuständen, die als „erweiterte“ (E) und „kontrahierte“ (C) Konformationen bezeichnet werden und beide eine Gesamtauflösung von 3,1 Å aufweisen (Extended Data Abb. 3 und 5). ). Eine dritte Klasse umfasst die Hilfsuntereinheit ARRD-6 und wurde mit einer Auflösung von 3,5 Å aufgelöst (Extended Data Abb. 4 und 5). Da die E-Konformation einige deutlichere Dichtemerkmale aufweist als die C-Konformation, konzentrieren wir uns in unserer ersten Diskussion der Gesamtstruktur auf die E-Konformation.

Der TMC-1-Komplex liegt als Dimer vor, mit einer zweizähligen Rotationssymmetrieachse, die an einer Kontaktstelle zwischen den beiden TMC-1-Untereinheiten zentriert ist (Abb. 1). Die Transmembranhelices weisen eine überdurchschnittlich gute lokale Auflösung auf, während ungeordnete oder dynamische periphere Komponenten des Komplexes mit einer geringeren Auflösung aufgelöst werden (Abb. 1b). Bei Betrachtung senkrecht zur Membranebene hat der Komplex die Form einer Acht, wobei die TMC-1-Untereinheiten in den Lappen der Acht zentriert sind (Abb. 1d). Jedes TMC-1-Protomer besteht aus zehn Transmembranhelices mit einer Gesamtanordnung, die an die Ca2+-aktivierte Lipid-Scramblase26, die TMEM16-Cl−-Kanäle27 und die mechanosensitiven OSCA-Ionenkanäle28,29 (Extended Data Abb. 6) erinnert, in Übereinstimmung mit den vorhergesagten Strukturen von TMC-17,30. An der Verbindungsstelle der achtlappigen Lappen besteht die Dimerschnittstelle aus domänengetauschten Transmembranhelix 10 (TM10)-Helices (Abb. 1e), wobei die Kontakte durch Van-der-Waals- und elektrostatische Wechselwirkungen sowie durch die Vergrabung von 1.781 definiert werden Å2 der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche. Zahlreiche wohlgeordnete Lipidmoleküle umgeben die Transmembrandomäne, von denen viele in den Rillen zwischen den Transmembranhelices eingelagert sind und einige von ihnen in großen Winkeln zur Membranebene positioniert sind.

a, Schematische Darstellung von Proteinkonstrukten, die gemeinsam mit TMC-1 gereinigt wurden. EF1–EF3, EF-Hand-Domänen; TM, Transmembrandomäne. b: Karte mit lokaler Auflösung des nativen TMC-1-Komplexes nach 3D-Rekonstruktion. c, Gesamtarchitektur des nativen TMC-1-Komplexes, parallel zur Membran betrachtet. TMC-1 (dunkelblau und hellblau), CALM-1 (orange und gelb) und TMIE (rot und rosa) werden in einem Cartoon-Diagramm dargestellt. Lipidähnliche Moleküle, N-Glykane und mutmaßliche Ionen sind jeweils schwarz, grün und dunkelrot gefärbt. d, Zytosolische Ansicht der rekonstruierten Karte, passend zum Modell. Die Untereinheitsdichten sind wie in c gefärbt und die Waschmittelmizelle ist in Grau dargestellt. e: Eine extrazelluläre Ansicht des TMC-1-Komplexes von oben nach unten zeigt die domänengetauschte dimere Schnittstelle. α-Helices werden als Zylinder dargestellt.

Die zytosolische Domäne ist bereit, umfangreiche Wechselwirkungen mit dem inneren Blättchen der Membran einzugehen und umfasst sechs Helices, die nahezu parallel zur Membran ausgerichtet sind. Die beiden Helices, die dem inneren Blättchen am nächsten liegen, Helix 3 (H3) und H4, sind amphipathisch, ein gemeinsames Merkmal mechanosensitiver Ionenkanäle (Abb. 1c, d). Der kurze Linker zwischen TMC-1 H3 und H4 besteht aus unpolaren Resten, die mit der inneren Blättchenmembran interagieren und hydrophobe Kontakte mit den Acylketten zweier Lipide bilden. Der etwa 400 Reste umfassende zytosolische C-Terminus von TMC-1, der vermutlich teilweise strukturiert ist, war in der Kryo-EM-Karte nicht sichtbar. Da die massenspektrometrische Analyse des gereinigten MT-Komplexes neun Peptide identifizierte, die den gesamten C-Terminus abdeckten, vermuten wir, dass diese Region im TMC-1-Komplex intakt, aber aufgrund der Konformationsheterogenität nicht sichtbar ist (Extended Data, Abb. 2).

Drei teilweise strukturierte Schleifen schmücken die extrazelluläre Seite des TMC-1-Komplexes. Zwei der Schleifen sind etwa 60 Reste lang, überbrücken TM1–TM2 und TM9–TM10 und sind zwischen Wirbeltieren und C. elegans TMC-1 gut konserviert. Dichtemerkmale, die mit der Glykosylierung übereinstimmen, finden sich bei N209, das sich in der Schleife zwischen TM1 und TM2 befindet. Im Gegensatz dazu wurde die etwa 200 Reste umfassende extrazelluläre Schleife, die TM5 und TM6 verbindet, in der Kryo-EM-Karte nicht beobachtet. Wir haben in der Massenspektrometrieanalyse zwei Peptide aus dieser Region entdeckt (Extended Data Abb. 2), was darauf hinweist, dass die Schleife vorhanden, aber aufgrund der Flexibilität nicht sichtbar ist. Es wird vorhergesagt, dass diese Region Elemente der Sekundärstruktur sowie drei vorhergesagte Stellen der N-verknüpften Glykosylierung enthält, ihre Funktion ist jedoch unklar. Die Schleife ist zwischen TMC-1 und TMC-2 nicht gut konserviert und ihre Länge bei TMC-1 von Wirbeltieren ist mit etwa 50 Resten wesentlich kürzer.

Zwei zusätzliche Untereinheiten, CALM-1 und TMIE, die jeweils in zwei Kopien vorliegen, vervollständigen das Ensemble der Proteine, die mit dem „Kern“-TMC-1-Komplex verbunden sind. Die Qualität der Kryo-EM-Karte ermöglichte eine eindeutige Zuordnung der CALM-1- und TMIE-Hilfsuntereinheiten (Abb. 1c) zu Dichtemerkmalen der TMC-1-Komplexkarte in Übereinstimmung mit den Massenspektrometriedaten. Die CALM-1-Untereinheiten „greifen“ an den zytosolischen Flächen jedes TMC-1-Protomers, und jede der beiden TMIE-Untereinheiten überspannt die Membran, „schwebt“ nahezu an der Peripherie des Komplexes und flankiert jede TMC-1-Untereinheit. CALM-1 stellt umfangreiche Kontakte mit fünf der sechs zytosolischen Helices her und bildet eine „Kappe“ an der Basis der TMC-1-Transmembrandomäne. Im Gegensatz dazu definieren die TMIE-Untereinheiten die distalen Ränder des Komplexes und sind nur an einer Handvoll Protein-Protein-Kontakten an den extrazellulären und zytosolischen Grenzen der membranübergreifenden Regionen beteiligt, jedoch mit Lipid-vermittelten Wechselwirkungen über die Transmembranregionen. Parallel zur Membran und senkrecht zur Längsseite des Komplexes betrachtet ähnelt die Anordnung der Untereinheiten einer Ziehharmonika, wobei die TMIE-Transmembranhelices die Instrumentengriffe bilden und die TMC-1-Transmembrandomäne den Balg definiert (Abb. 1c).

TMIE ist eine wesentliche Untereinheit des Wirbeltier-MT-Komplexes, die für die TMC-1-vermittelte mechanosensorische Transduktion in Cochlea-Haarzellen32 und in sensorischen Haarzellen von Zebrafischen10 notwendig ist. Mehrere Punktmutationen bei TMIE sind mit Taubheit verbunden (Extended Data Abb. 7), und neuere Studien deuten auf eine Rolle von TMIE bei der Lokalisierung und Kanalsteuerung von TMC-1 und TMC-2 hin9,10,11,33,34,35. Der TMC-1-Komplex von C. elegans enthält zwei Kopien von TMIE, die sich auf der „Außenseite“ jedes TMC-1-Protomers befinden (Abb. 2a). TMIE besteht aus einer einzelnen Transmembrandomäne, gefolgt von einem „ellbow-like“ Linker und einer zytosolischen Helix (Abb. 2b). Der flexible, positiv geladene C-terminale Schwanz war in der Kryo-EM-Karte nicht sichtbar. Die Wechselwirkung zwischen TMIE und TMC-1 wird hauptsächlich durch den zytosolischen TMIE-Ellbogen vermittelt, wobei die hochkonservierten R49 und R52 Wasserstoffbrückenbindungen mit Rückgrat-Carbonylatomen in TMC-1 TM6 bzw. TM8 bilden (Abb. 2c, e). Diese Argininreste können bekannten Taubheitsmutationen beim Menschen (R81C und R84W) zugeordnet werden, was die Bedeutung dieser Wasserstoffbrückenbindungen bei der TMIE-TMC-1-Wechselwirkung hervorhebt. Hydrophobe Kontakte zwischen unpolaren Resten im TMIE-Ellbogen und TMC-1 TM6 verstärken wahrscheinlich den Komplex. Darüber hinaus kontaktiert W25 von TMIE nahe der extrazellulären Grenze L228 in der Schleife zwischen TMC-1 TM1 und TM2 (Abb. 2d). Die Mutation des entsprechenden Rests beim Menschen (W57) zu einem Stoppcodon ist eine Ursache für Taubheit36. Wir haben in der Kryo-EM-Karte keine Dichte für die N-terminalen 17 Reste von TMIE beobachtet, und Peptide aus dieser Region wurden in der Massenspektrometrieanalyse nicht nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass der N-Terminus ein gespaltenes Signalpeptid enthält (ergänzende Abbildung 2). ). Die N-terminale Sequenzierung von rekombinant exprimiertem Maus-TMIE stimmt auch mit der Spaltung eines Signalpeptids überein (ergänzende Abbildung 2), ebenso wie Verkürzungsexperimente von Zebrafisch-TMIE10, was die Hypothese stützt, dass in C. elegans die ersten etwa 17 Reste von TMIE als funktionieren ein Signalpeptid.

a: Die schematische Darstellung der Transmembranhelices von TMC-1 (blau) und TMIE (rot) verdeutlicht die Nähe von TMIE zum mutmaßlichen TMC-1-Ionenleitungsweg. Die Palmitoylierung von TMIE C44 und Phospholipiden (PL) ist schwarz dargestellt. b, Überblick über die Interaktionsschnittstelle zwischen TMIE und TMC-1, von der Seite betrachtet. c, Die Schnittstelle zwischen dem TMIE-„Ellenbogen“ und TMC-1. Wechselwirkende Reste werden als Stäbchen dargestellt. d, Die Schnittstelle zwischen der TMIE-Transmembranhelix und TMC-1, wobei wichtige Reste und Lipide hervorgehoben werden. Die Palmitoylierung ist in Rot und Phospholipid in Schwarz dargestellt. e, Mehrfachsequenz-Alignment von TMIE-Orthologen. Elemente der Sekundärstruktur werden über den Sequenzen angezeigt und Schlüsselreste werden durch schwarze Pfeile angezeigt. Reste in Schwarz werden nicht konserviert, die in Rot werden konservativ ersetzt und die in Fettdruck Rot werden konserviert.

TMIE und TMC-1 bilden einen intramembranösen Hohlraum, der von mehreren Detergens- oder Lipidmolekülen besetzt ist. Mehrere Lipide stellen hydrophobe Kontakte mit unpolaren Resten in TMIE und den mutmaßlichen porenbildenden TMC-1-Helices TM6 und TM8 her und verbinden so die beiden Untereinheiten. In Übereinstimmung mit der beobachteten Lipiddichte in den Kryo-EM-Karten identifizieren Molekulardynamiksimulationen unabhängig voneinander mehrere Lipide in diesem Hohlraum (Extended Data Abb. 10). Bemerkenswert ist, dass C44 von TMIE an der zytosolischen Grenze der Transmembrandomäne palmitoyliert ist, wobei sich die Acylkette entlang TMC-1 TM8 erstreckt (Abb. 2d, e). Die Lage von TMIE in der Nähe der mutmaßlichen TMC-1-Pore und seine Lipid-Wechselwirkungen legen nahe, dass TMIE und möglicherweise Lipide eine Rolle bei der Gating-Funktion durch Messung der Membranspannung spielen. Diese Idee wird durch aktuelle Studien an Cochlea-Haarzellen von Mäusen gestützt, die zeigten, dass TMIE an Phospholipide bindet und dass seine Assoziation mit Lipiden für die mechanosensorische Transduktion von TMC-1 wichtig ist11.

CIB2 und sein Homolog CIB3 modulieren die Aktivität des MT-Komplexes und binden an die TMC-1-Untereinheit12,14. In Übereinstimmung mit der Rolle von CIB2 und CIB3 bei der MT-Kanalfunktion sind Mutanten von CIB2 mit nicht-syndromischem Hörverlust verbunden25,37,38. Unsere Massenspektrometrieergebnisse (Extended Data Abb. 2) zeigen, dass CALM-1, das C. elegans-Ortholog von CIB2, gemeinsam mit TMC-1 gereinigt wird, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass CALM-1 im TMC-1-Komplex residiert. Die Untersuchung der Karte des TMC-1-Komplexes zeigt Dichtemerkmale für zwei CALM-1-Untereinheiten auf den zytosolischen Flächen jedes TMC-1-Protomers. Mithilfe der Kristallstruktur von CIB3 im Komplex mit einem TMC-1-Peptid14 passen wir Modelle von CALM-1 an ihre jeweiligen Dichtemerkmale an (Abb. 3a). Ähnlich wie andere CIB-Proteine ​​verfügt CALM-1 über drei EF-Hand-Motive, von denen zwei proximal zum C-Terminus liegen und klar gebundene Ca2+-Ionen enthalten. Nach der Überlagerung beträgt die quadratische Abweichung zwischen CALM-1 und CIB3 vom CIB3-TMC-1-Peptidkomplex 0,69 Å und unterstreicht zusammen mit einer erheblichen Sequenzähnlichkeit die Erhaltung der Sequenz und Struktur zwischen den Wurm- und Mausproteinen (Ergänzende Abbildung 3).

a,b, Die Bindungsschnittstelle zwischen CALM-1 und TMC-1, gesehen parallel zur Membran (a) und senkrecht zur Membran (b). c, Bindungsschnittstelle zwischen CALM-1 und TMC-1 H1–H3. Dargestellt ist die elektrostatische Oberfläche von TMC-1, wobei Blau positive Bereiche und Rot negative Bereiche darstellt. CALM-1 wird gelb angezeigt. d, Die Schnittstelle zwischen CALM-1 und TMC-1 H5 und H6. e, Salzbrücken zwischen dem C-Terminus von CALM-1 und TMC-1. Mutmaßliche Wasserstoffbrückenbindungen sind als gestrichelte Linien dargestellt. f, Dreidimensionale Rekonstruktion des TMC-1-Komplexes mit ARRD-6 parallel zur Membran betrachtet. TMC-1, CALM-1, TMIE und ARRD-6 werden jeweils in Blau, Gelb, Rot und Grün angezeigt. Das rot gestrichelte Rechteck zeigt die mutmaßliche Einfügungsstelle der ARRD-6 C-Edge-Schleife in die Mizelle an. Über der Rekonstruktion ist ein schematisches Diagramm von ARRD-6 mit Arrestin-N- (Arr-N) und C- (Arr-C) Domänen dargestellt. g, Die Schnittstelle zwischen der C-Edge-Schleife von ARRD-6 und der Membran. ARRD-6-Reste, die wahrscheinlich an Membraninteraktionen beteiligt sind, sind als Stäbchen dargestellt. h, Die Schnittstelle zwischen ARRD-6 (grün) und CALM-1 (gelb), wobei Reste hervorgehoben werden, die für die Bindungsinteraktion wichtig sind.

Umfangreiche Wechselwirkungen binden CALM-1 und TMC-1 aneinander, was eine vergrabene Oberfläche von etwa 2.903 Å2 umfasst und darauf hindeutet, dass CALM-1 mit hoher Affinität an TMC-1 binden könnte (Abb. 3a). Drei verschiedene Regionen von CALM-1 interagieren mit den zytosolischen helikalen Merkmalen von TMC-1, wobei die erste die TMC-1-Helices H1 bis H3 umfasst, die wie „Paddel“ nahezu parallel zur Membran ausgerichtet sind (Abb. 3b, c). Zu den prominenten Wechselwirkungen gehören Seitenketten in der Schleife zwischen H1 und H2, die hydrophobe Kontakte mit CALM-1 bilden, sowie saure Reste auf CALM-1, die eine negativ geladene Oberfläche neben einer komplementär positiv geladenen Oberfläche auf dem H1-H3-Paddel erzeugen ( Abb. 3c). Die zweite Bindungsschnittstelle verläuft durch eine hydrophobe Tasche von CALM-1, die aus seinen EF-Hand-Motiven und den zytosolischen H5-H6-Helices von TMC-1 besteht (Abb. 3d), die an die CIB3-TMC-1-Peptidstruktur erinnern. Aliphatische und aromatische Reste, einschließlich L308, F309 und Y314 von TMC-1, werden an den konservierten hydrophoben Kern in CALM-1 angedockt, wodurch der Komplex durch das Vergraben einer beträchtlichen unpolaren Oberfläche weiter stabilisiert wird. Schließlich interagieren die Aminosäuren D192, R195 und R200 am C-Terminus von CALM-1 mit R780, D313 bzw. E160 von TMC-1 und bilden konservierte Salzbrücken durch die vergrabene kurze Helix (191–197) von CALM-1 ( Abb. 3e). Diese Schnittstelle zeigt, dass CALM-1 über die Schleife zwischen TM8 und TM9 direkt mit den Transmembranhelices von TMC-1 in Kontakt kommt und somit in der Lage ist, die Funktion des Ionenkanals zu modulieren.

Mehrere Missense-Mutationen von menschlichem CIB2 oder TMC-1 sind mit nicht-syndromischem Hörverlust verbunden, indem sie entweder die Interaktion zwischen TMC-1 und CIB2 behindern oder die Ca2+-Bindungsneigung von CIB214 verringern. Mehrere dieser Reste, E178D von menschlichem TMC-1 und E64D, F91S, Y115C, I123T und R186W von CIB2, sind im C. elegans TMC-1- und CALM-1-Komplex strukturell konserviert (ergänzende Abbildung 3). Unsere Struktur beleuchtet die Nähe der CALM-1-Ca2+-Bindungsstellen zur CALM-1- und TMC-1-Schnittstelle und unterstreicht so die Rolle von Ca2+ und CALM-1 bei der Gestaltung der Konformation von TMC-1 und durch Extrapolation Strukturelles Verständnis von CIB2 in der Haarzellenfunktion.

Die massenspektrometrische Analyse des TMC-1-Komplexes zeigte das Vorhandensein des löslichen Proteins ARRD-6. Bei der Klassifizierung der Einzelpartikel-Kryo-EM-Daten beobachteten wir eine nicht zweifach symmetrische 3D-Klasse, die durch ein längliches Dichtemerkmal definiert wurde, das aus der CALM-1-Hilfsuntereinheit hervorsteht, und stellten die Hypothese auf, dass sie ARRD-6 entsprach. Arrestine bestehen aus einer N-Domäne und einer C-Domäne, die jeweils aus β-Sandwich-Motiven bestehen, die zusammen ein Protein mit einer länglichen, bohnenähnlichen Form ergeben. Wir passen die vorhergesagte Struktur von ARRD-6 in das entsprechende Dichtemerkmal ein und obwohl die lokale Auflösung der ARRD-6-Region geringer ist als die der zentralen Region des Komplexes, ergab die Anpassung Gesamtkorrelationskoeffizienten von 0,69 (Maske) und 0,65 ( Volumen) (Extended Data Abb. 5). Darüber hinaus sind Dichtemerkmale für die ARRD-6-β-Faltblätter an der Bindungsschnittstelle mit CALM-1 sowie für die gekreuzten verlängerten Schleifen der N- und C-Domänen am zentralen Kamm deutlich zu beobachten, was die Zuordnung der Dichte weiter unterstützt Funktion zu ARRD-6. Wir beobachteten eine „C-Edge-Loop“-Struktur, die am distalen Rand der β-Stränge in der C-Domäne positioniert ist, ein Merkmal, das als Membrananker fungiert und für die Aktivierung von Arrestin39 notwendig ist (Abb. 3f, g). Die C-Edge-Schleife von ARRD-6 umfasst W197 und mehrere Cysteinreste (Abb. 3g), wobei letztere möglicherweise palmitoyliert sind und somit für die Membranverankerung geeignet sind40. Zusätzliche Kontakte zwischen CALM-1 und ARRD-6 beinhalten eine Schleife von CALM-1 (P51–K67) mit den β-Strängen in der C-Domäne von ARRD-6 (Abb. 3h). Die strukturelle Ausrichtung zeigt, dass die TMC-1-Konformation innerhalb des ARRD-6-Komplexes der E-Konformation am ähnlichsten ist. Die Rolle von Arrestin bei der Funktion des TMC-Kanals von C. elegans und im TMC-1-Komplex von Wirbeltieren ist weiterhin unbekannt. Wir spekulieren, dass ARRD-6 möglicherweise eine regulatorische Rolle bei der TMC-1-Kanalfunktion spielt oder durch die Rekrutierung von Zytoskelettproteinen an der Endozytose des TMC-1-Komplexes beteiligt ist, ähnlich der Rolle von α-Arrestin bei der Regulierung von G-Protein- gekoppelte Rezeptoren41. Zu diesem Zeitpunkt wissen wir nicht, warum wir nur eine einzige an den Komplex gebundene ARRD-6-Untereinheit beobachtet haben, da genügend Platz für zwei vorhanden ist. Eine Untereinheit kann nicht an den Komplex gebunden sein oder die zweite Untereinheit ist möglicherweise nur teilweise besetzt. Zur Beantwortung dieser Fragen sind weitere Experimente erforderlich.

An Cochlea-Haarzellen gemessene Einzelkanalströme zeigen, dass der MT-Komplex von Säugetieren kationenselektiv ist42 und eine hohe Permeabilität für Ca2+ aufweist. TMC-1 oder TMC-2 sind die wahrscheinlich porenbildenden Untereinheiten des MT-Komplexes von Säugetieren, und Cystein-Mutageneseexperimente haben mehrere Porenauskleidungsreste identifiziert, die für die TMC-1-vermittelte mechanosensorische Transduktion entscheidend sind6,7 (Extended Data Abb. 7a). C. elegans TMC-1 vermittelt Mechanosensitivität in Wurm-OLQ-Neuronen und Körperwandmuskeln13, seine Ionenselektivität und Permeationseigenschaften sind jedoch nicht bekannt, was größtenteils auf Herausforderungen zurückzuführen ist, die mit der heterologen Expression des rekombinanten Komplexes und mit verschwindend geringen Mengen an nativem Material verbunden sind. Bemerkenswert ist, dass C. elegans und Maus-TMC-1 auch als Na+-durchlässige Leckkanäle fungieren, die das Ruhemembranpotential über eine depolarisierende Leckleitfähigkeit im Hintergrund modulieren, was darauf hindeutet, dass TMC-1 mehrere zelluläre Rollen übernehmen könnte23,43 und darauf hindeutet, dass die Kanalpore dies tut durchlässig für eine größere Ionenvielfalt als bisher angenommen.

Um einen Einblick in die Natur und Funktion des TMC-1-Ionenleitungswegs von C. elegans zu erhalten, überlagerten wir die TMC-1-Untereinheit mit den Strukturen von TMEM16A und OSCA1.2 und enthüllten so eine ähnliche Architektur unter den Transmembrandomänen (Extended Data Abb . 6). Die Dimeranordnungen TMEM16A und OSCA1.2 enthalten zwei Poren – eine in jeder Untereinheit –, die durch die Helices TM3–TM7 definiert werden. Strukturelle Ähnlichkeiten zwischen TMEM16a und OSCA1.2 legen nahe, dass TMC-1 möglicherweise auch zwei Poren aufweist und Ionen über einen strukturell analogen Weg bestehend aus TM4–TM8 leiten könnte (Abb. 4a). Der mutmaßliche Ionenleitungsweg scheint geschlossen zu sein, wobei eine schmale Pore durch drei Verengungen blockiert ist (Abb. 4b, c). Polare und basische Reste säumen die erste Verengungsstelle in der Nähe des extrazellulären Poreneingangs und unpolare Reste dominieren die zweite Verengungsstelle, die sich etwa 20 Å weiter unten im Leitungsweg in Richtung Zytoplasma befindet. Die Lage der zweiten Verengungsstelle stimmt gut mit der schmalen „Hals“-Region der mutmaßlichen OSCA1.2-Pore überein, die hauptsächlich aus hydrophoben Resten besteht, sowie mit dem hydrophoben TMEM16a-Gate28,44. Die verbleibenden 40 Å des Leitungswegs sind hauptsächlich von polaren und geladenen Resten ausgekleidet (Abb. 4d). Sieben Grundreste säumen die Pore, von denen zwei (H404 und H731) teilweise die dritte und engste Verengungsstelle definieren. Cystein-Mutagenese-Experimente haben acht Porenauskleidungsreste in Maus-TMC-17 identifiziert,45 und obwohl fünf dieser Reste in C. elegans nicht konserviert sind, sind die Positionen aller acht auf Porenauskleidungspositionen in C. elegans TMC-1 abgebildet (Extended Data Abb. 7a), was ihre Position im Ionenleitungsweg unterstützt. Wir haben zwei kugelförmige, nicht proteinhaltige Dichten in der Nähe von zwei sauren Resten (D683 und D695) sichtbar gemacht, die möglicherweise gebundenen Kationen entsprechen (Abb. 4b). Bei der derzeitigen Auflösung der Struktur können wir jedoch nicht feststellen, ob es sich bei diesen Merkmalen um Ca2+-Ionen handelt. Beide Asparaginreste sind im menschlichen TMC-1 konserviert, was darauf hindeutet, dass sie für die Ionenkoordination wichtig sind. Obwohl die ionisierbaren Reste, die die geschlossene Pore auskleiden, überwiegend basisch sind und daher nicht mit einem kanonischen Ca2+-permeablen Kanal übereinstimmen, der typischerweise saure Reste beherbergt, bleibt unbekannt, welche Reste den Permeationsweg in der offenen Konformation säumen. Darüber hinaus ähnelt die Gesamtzusammensetzung der Rückstände der des mechanosensitiven Ionenkanals OSCA1.228. OSCA1.2 zeigt durch Dehnung aktivierte, nicht selektive Kationenströme mit 17–21 % Cl−-Permeabilität46, was darauf hindeutet, dass C. elegans TMC-1 ähnliche Permeationseigenschaften aufweisen könnte.

a, Die Lage der Pore (Goldnetz) wird im Kontext des TMC-1-Komplexes gezeigt. Mutmaßliche Calciumionen werden als rote Kugeln dargestellt. b, Eine erweiterte Ansicht des Ionenpermeationswegs, wobei porenauskleidende Rückstände, dargestellt als Stäbchen, und mutmaßliche Ionen (rot) hervorgehoben sind. c, Van-der-Waals-Radius der Pore, aufgetragen gegen den Abstand entlang der Porenachse, berechnet mit MOLE 2,0. d, Das elektrostatische Potenzial porenauskleidender Rückstände wird in verschiedenen Farben dargestellt: grau, unpolar; gelb, polar; rot, sauer; und blau, einfach. Saure und basische Rückstände sind gekennzeichnet. e, Mehrfachsequenz-Alignment ausgewählter Reste von mutmaßlichen porenbildenden TMC-1-Helices.

Um die Ionenleitungspore des Wirbeltier-MT-Komplexes zu visualisieren, nutzten wir die Struktur des C. elegans-Komplexes und erstellten ein Homologiemodell des menschlichen TMC-1-Komplexes, das TMC-1, CIB2 und TMIE umfasst (Extended Data Abb. 8). ). Bei der Untersuchung dieser Struktur stellten wir fest, dass die mutmaßliche Pore mit zwei basischen Resten und fünf sauren Resten ausgekleidet ist, was darauf hindeutet, dass der Kanal für Ca2+ durchlässig ist. Darüber hinaus gibt es im Vergleich zum Wurmortholog relativ mehr polare Reste und die Histidinreste, die die zweite Verengungsstelle in C. elegans TMC-1 verschließen, werden im menschlichen Modell durch M418 und A579 ersetzt. Der Wirbeltier-MT-Komplex verleiht Haarzellen auch Durchlässigkeit für organische Moleküle, einschließlich des Farbstoffs FM1–4347. Obwohl unsere Struktur keinen direkten Einblick in den Weg der Permeation kleiner Moleküle bietet, bieten mehrere hydrophobe Spalten – einschließlich des mit Lipiden ausgekleideten Raums zwischen TMC-1 und TMIE – mögliche Wege für die Transmembranpassage kleiner Moleküle wie FM1–43.

Wir beobachteten durch 3D-Klassifizierung eine zweite Konformation des TMC-1-Komplexes, die als C-Konformation bezeichnet wird (Extended Data Abb. 9). Die TMC-1-Untereinheiten in der E- und C-Konformation haben eine ähnliche Gesamtstruktur, beide einschließlich geschlossener Ionenkanäle. In der C-Konformation ist die TM10-Helix jedoch im Vergleich zur E-Konformation um etwa 9° gebogen, und in der E-Konformation gibt es eine zusätzliche Helixwindung von TM10. Bei der sukzessiven Überlagerung der TMC-1-Untereinheiten aus den C- und E-Komplexen beobachteten wir, dass im E-Zustand jede Hälfte des TMC-1-Komplexes, bestehend aus TMC-1-, CALM-1- und TMIE-Untereinheiten, um etwa 8 gedreht ist ° im Vergleich zum C-Zustand über eine Rotationsachse, die sich in der Nähe der TMC-1-H7- und H8-Helices befindet und ungefähr parallel zur Membran ausgerichtet ist. Die Bewegung jeder Hälfte des Komplexes – parallel zur Membranebene betrachtet – ähnelt somit der Bewegung einer Ziehharmonika, wobei die zytoplasmatischen Regionen des Komplexes im Vergleich zu denen auf der extrazellulären Seite der Membran relativ größere Konformationsverschiebungen erfahren. Tatsächlich bewegen sich die amphipathischen TMC-1-H3-Helices beim Vergleich der C- und E-Zustände um etwa 11 Å weiter auseinander, was das Ausmaß der Konformationsänderung unterstreicht. Wie unten beschrieben, gehen diese Veränderungen mit erheblichen Veränderungen in der Struktur und dem mechanischen Verhalten der das Protein umgebenden Membran einher (Extended Data Abb. 9). Weitere Studien werden jedoch erforderlich sein, um ihre Auswirkungen auf die Funktion des MT-Komplexes zu bestimmen. Dennoch veranschaulichen diese Ergebnisse die Konformationsplastizität des TMC-1-Komplexes und umgekehrt die Möglichkeit, dass Verformungen der Membran Konformationsänderungen im TMC-1-Komplex hervorrufen können.

Um zu verstehen, wie der TMC-1-Komplex mit einzelnen Lipiden sowie mit der Lipiddoppelschicht interagiert, führten wir atomare und grobkörnige Molekulardynamiksimulationen sowohl für die E- als auch für die C-Komplexe durch, die in Membranen aus Phospholipiden und Cholesterin eingebettet sind (Erweiterte Daten). Abb. 10a). Der All-Atom-Satz umfasste drei unabhängige Simulationen für jeden Konformationszustand des Proteins, was eine kollektive Abtastzeit von 6 μs ergab, während die grobkörnigen Läufe auf größeren Membranflecken durchgeführt wurden, die jeweils vier Kopien von TMC-1 in entweder E oder enthielten C-Konformationen (Extended Data Abb. 10a) und jeweils für 10 μs simuliert, was zu einer kollektiven Abtastzeit von 80 μs für Lipid-Protein-Wechselwirkungen führt. Die Untersuchung der ausgeglichenen Membranstruktur um den TMC-1-Komplex zeigt ein tiefes Eindringen und eine tiefe Verankerung der amphipathischen Paddel-H3-Helix im zytosolischen Blättchen der Doppelschicht (Abb. 5a, b). In Übereinstimmung mit den Kryo-EM-Dichtekarten zeigen die Simulationen, dass Phospholipide und Cholesterin den Hohlraum zwischen TMIE und TMC-1 besetzen und Cholesterin in Spalten in der Nähe der mit der zweifachen Symmetrie verbundenen TM10-Helices an der TMC-1-Untereinheit angereichert ist Schnittstelle, was zusammen die Bedeutung von Lipiden für die Struktur und Funktion des Komplexes unterstützt (Erweiterte Daten Abb. 10b, c). Der TMC-1-Komplex verzerrt auch die Membrandoppelschicht und fördert sowohl die Ausdünnung als auch die Verdickung der Membran in ihrer Umgebung, wobei die zytoplasmatische Packungsbeilage im Bereich der H3-Helix-Insertion besonders deutlich dünner wird (Abb. 5c und erweiterte Daten Abb. 10d). Bemerkenswert ist, dass die E- und C-Konformationen unterschiedliche Membranverformungsmuster erzeugen (Abb. 5c und erweiterte Daten Abb. 9b und 10d, e). Insbesondere führt die E-Konformation zu einer ausgeprägteren Membranverzerrung (Verdickung und Verdünnung) in der Nähe des Proteins, was zu einer Ausbreitung der Membranverformung über einen längeren Bereich (etwa 50 Å vom Protein entfernt) führt (Extended Data Abb. 10d, e).

a: Molekulardynamiksimulation des membraneingebetteten TMC-1-Komplexes (E-Konformation) zeigt das Eindringen der H3-Helix in die Lipiddoppelschicht. b, Schlüsselreste, die die amphipathische Natur der H3-Helix definieren, sind als Stäbchen dargestellt. c, Dickenmuster für extrazelluläre und zytosolische Membranblätter, gemittelt über die letzten 500 ns von drei simulierten Replikaten für die E-Konformation. Das Muster für die C-Konformation ist in Abb. 8 der erweiterten Daten dargestellt. Der Querschnitt des Proteins ist in Blau dargestellt und die Position des Querschnitts ist über den Diagrammen anhand einer Oberflächendarstellung des TMC-1-Komplexes angegeben. d, Schematische Darstellung der Mechanismen, durch die direkte oder indirekte Kräfte auf die Ionenkanalsteuerung übertragen werden könnten. Graue Pfeile (rechts) zeigen, wie die Membranspannung den TMC-1-Komplex direkt steuern könnte, indem sie Kraft auf TMIE ausübt. Indirekte Kräfte infolge von Änderungen der Membrandicke könnten die Position der in die Membran eingebetteten Helix H3 beeinflussen und so die Ionenkanalsteuerung modulieren.

Die molekularen Strukturen des TMC-1-Komplexes offenbaren die Identität, Architektur und Membranassoziation wichtiger Untereinheiten, die für die mechanosensorische Transduktion von Wirbeltieren und C. elegans von zentraler Bedeutung sind. Der ziehharmonikaförmige, zweifach symmetrische Komplex enthält TMIE-Untereinheiten, die wie Griffe senkrecht zur Membran positioniert sind, und amphipathische TMC-1-H3-Helices, die parallel zur Membranebene eingefügt sind und jeweils mögliche Mechanismen für die direkte oder indirekte Kraftübertragung auf den Ionenkanal bereitstellen Gating bzw. Wechselwirkungen zwischen TMIE und TMC-1 sind auf die extrazellulären und intrazellulären Grenzen von TMIE TM1 beschränkt, was zu einem großen intramembranösen Hohlraum zwischen den beiden Untereinheiten führt, der unserer Hypothese nach mit Lipidmolekülen in einer Plasmamembranumgebung gefüllt ist. TMIE ist in der Nähe der mutmaßlichen porenbildenden Helices TM4–8 positioniert (Abb. 2a) und interagiert direkt mit TMC-1 TM6 und TM8 über Wasserstoffbrückenbindungen und über die am TMIE-Rest C44 angebrachte Palmitoylgruppe. Die Anordnung der Untereinheiten ähnelt einem Akkordeon, wobei TMIE die Instrumentengriffe bildet. Wir spekulieren, dass die auf TMIE ausgeübte Kraft, entweder über die Membran oder über direkte Kontakte mit einer Hilfsuntereinheit, dann an die porenbildenden TMC-1-Transmembranhelices gekoppelt wird und die Pore öffnet, um die Ionenpermeation zu ermöglichen.

Bei Wirbeltieren überträgt Protocadherin-15 Kraft auf die Spitzen der Stereozilien und öffnet so den MT-Kanal. Frühere Studien haben gezeigt, dass Protocadherin-15 einen stabilen dimeren Komplex mit LHFPL5 bildet, aber auch mit TMC-1- und TMIE-Untereinheiten interagiert9,15,17,48,49, aber wie diese Interaktion stattfinden könnte, ist unbekannt. Eine Möglichkeit besteht darin, dass das Protocaderin-15-Dimer mit der zweizähligen Achse des TMC-1-Komplexes zusammenfällt, wobei Procadherin-15-Transmembranhelices die TMC-1-TM10-Helixe umgeben. Dieser geschlossene symmetrische dimere Komplex würde es ermöglichen, die Spannung von Protocadherin-15 über die Protocadherin-15-Kontakte mit den TM10-Helices direkt auf den TMC-1-Komplex zu übertragen. Alternativ könnten Protocadherin-15-Dimere mit TMIE-Helices interagieren, wobei eine Protocadherin-Untereinheit mit einer einzelnen TMIE-Untereinheit interagiert und so einen offenen Komplex bildet, in dem die ungepaarte Protocadherin-15-Untereinheit mit einer TMIE-Untereinheit aus einem anderen TMC-1-Komplex interagieren könnte (Abb . 5d). Dieses Modell bietet sowohl einen direkten Mechanismus für die Kraftübertragung von Protocadherin-15 auf TMIE und dann auf die Pore des TMC-1-Ionenkanals als auch einen Mechanismus für die Clusterbildung von TMC-1-Komplexen50. Zusätzlich zur direkten Kraftübertragung vermuten wir auch, dass H3 der TMC-1-Untereinheit wie ein Paddel in der Membran wirkt, das sich nach oben oder unten bewegt, wenn die Membran dünner oder dicker wird, und so einen Mechanismus für die Kraftkopplung mit dem Kanal bereitstellt die Membran. Weitere Untersuchungen der offenen Kanalkonformationen des TMC-1-Komplexes von C. elegans sowie der Strukturen des Wirbeltier-MT-Komplexes werden erforderlich sein, um die Mechanismen der Kraftübertragung vollständiger aufzuklären. Dennoch bilden diese TMC-1-Komplexe ein Gerüst für strukturbasierte Mechanismen der Berührung bei C. elegans und des Hörens und Gleichgewichts bei Wirbeltieren.

Der Stamm PHX2173 tmc-1 (syb2173) wurde von SunyBiotech mithilfe der CRISPR-Cas9-Genombearbeitung generiert und wird als tmc-1::mVenus-Linie bezeichnet (ergänzende Abbildung 1). Die TMC-1-mVenus-3×Flag-Sequenz wurde vor dem Stoppcodon des endogenen tmc-1-Gens (Wormbase: T13G4.3.1) eingefügt. Der Genotyp wurde mithilfe von PCR und den Primern ER02-seq-s (ATTAGATCCCGCAAGAGAAT) und ER02-seq-a (AAGGTGATATGAACGAACCG) bestätigt, die 452 bp stromaufwärts bzw. 408 bp stromabwärts von der Insertionsstelle binden, um die Region von Interesse zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde anschließend unter Verwendung der Primer ER02-mid-s (CATGAAGCAACACGACTTCT) und ER02-mid-a (TCTTCGATGTTGTGACGGAT) sequenziert, die innerhalb der TMC-1-mVenus-3×Flag-Sequenz binden. Um die Elution des manipulierten TMC-1-Komplexes aus Affinitätschromatographieharz zu ermöglichen, wurde eine PreScission-Protease (3C)-Spaltungsstelle zwischen dem C-Terminus von TMC-1 und dem mVenus-Fluorophor platziert.

Erwachsene Würmer wurden in M9-Puffer (22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl und 1 mM MgCl2) mit 30 mM Natriumazid immobilisiert und auf Objektträger gelegt, die mit ~4 mm Agar-Pads vorbereitet waren. Spektralbilder wurden mit einem 34-Kanal-Inversmikroskop LSM 880 Fast Airyscan von Zeiss mit einem 40 × 1,2 NA-Wasserimmersionsobjektiv aufgenommen. Zur Unterscheidung zwischen dem mVenus-Signal und der Autofluoreszenz wurde eine lineare Entmischung eingesetzt. Das Autofluoreszenzsignal wurde von jedem Bild subtrahiert. Die 3D-Z-Stapel-Informationen werden in 2D dargestellt, nachdem eine Projektion mit maximaler Intensität durchgeführt wurde.

Alle C. elegans-Stämme wurden gemäß den Wormbook-Methoden (http://www.wormbook.org) gepflegt und gezüchtet. Für die Flüssigkultur im großen Maßstab wurden Agarplatten mit Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) vorbereitet und mit dem E. coli-Stamm HB101 bestrichen, sodass der Bakterienrasen über Nacht bei 37 °C wachsen konnte. Die Würmer wurden auf die NGM-Platten übertragen und 3–4 Tage lang bei 20 °C gezüchtet, bis die HB101-Zellen aufgebraucht waren. Die Würmer auf den Platten wurden in ein flüssiges Medium in 2-l-Kolben mit Schikanen überführt, das mit HB101 (~15 g pro 500 ml Medium) und Streptomycin (50 μg ml−1) ergänzt war, und die Würmer wurden bei 20 °C unter kräftigem Schütteln gezüchtet ( 150 U/min) für 70–72 Stunden. Um Würmer zu sammeln, wurden die Flüssigkulturflaschen eine Stunde lang auf Eis gestellt, damit sich die Würmer absetzen konnten. Das Medium wurde entfernt und die Wurmaufschlämmung in einem Röhrchen gesammelt, zweimal mit 50 ml eiskaltem M9-Puffer durch aufeinanderfolgende Zentrifugation (800 g für 1 Minute) und Resuspension gewaschen. Die Würmer wurden durch 5-minütige Saccharose-Dichtezentrifugation bei 1.500 g „gereinigt“, nachdem das Volumen der Wurmaufschlämmung mit M9-Puffer auf 25 ml gebracht und 25 ml eiskalte 60 % (Gew./Vol.) Saccharose hinzugefügt wurden. Die darüber liegende Wurmschicht wurde entnommen und in ein neues Röhrchen gegeben und dann zweimal mit 50 ml eiskaltem M9-Puffer gewaschen. Das Volumen des Wurmpellets wurde gemessen und das gleiche Volumen M9-Puffer in das Röhrchen gegeben und durch Eintropfen der Aufschlämmung in flüssigen Stickstoff wurden Wurmkugeln hergestellt. Die Schneckenkugeln wurden bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C gelagert.

Ungefähr 80 g gefrorene Schneckenkugeln wurden mit einer Kugelmühle (MM400, Retch) zerkleinert, wobei Mahlgefäß und Kugel in flüssigem Stickstoff vorgekühlt wurden. Aufgeschlossenes Wurmpulver wurde 2 Stunden lang bei 4 °C in einem Puffer gelöst, der 50 mM Tris-Cl (pH 9,3), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 % (Gew./Vol.) Glykodiosgenin (GDN) und Protease enthielt Inhibitoren (0,8 µM Aprotinin, 2 µg ml-1 Leupeptin und 2 µM Pepstatin). Nach 50-minütiger Zentrifugation bei 40.000 U/min (186.000 g) wurde der Überstand auf Anti-Flag M2-Affinitätsharz (A2220, Sigma-Aldrich) aufgetragen und über Nacht auf einem Rotator bei 4 °C inkubiert. Das Harz wurde fünfmal mit einem Puffer gewaschen, der 20 mM Tris-Cl (pH 8,5), 150 mM NaCl und 0,02 % (Gew./Vol.) GDN enthielt, wobei ein Puffervolumen verwendet wurde, das dem 200-fachen des Harzvolumens entsprach. Der TMC-1-Komplex wurde durch 4-stündige Inkubation mit 40 μg 3C-Protease bei 4 °C auf dem Rotator eluiert. Anschließend wurde die Lösung mit 3 mM CaCl2, Endkonzentration, ergänzt und das Eluat mit einem 0,22 µm Zentrifugenröhrchenfilter filtriert. Das Konzentrat wurde auf eine SEC-Säule (Superose 6 Boost 10/30 GL, GE Healthcare) geladen und in einem Puffer aus 20 mM Tris-Cl (pH 8,5), 150 mM NaCl, 0,02 % (Gew./Vol.) GDN äquilibriert 3 mM CaCl2. Die Peakfraktionen des mutmaßlichen dimeren TMC-1-Komplexes wurden gepoolt und für die Kryo-EM-Gittervorbereitung konzentriert. Aus 80 g Wurmknäueln wurden etwa 50 ng TMC-1 isoliert, was etwa 6 × 107 Würmern entspricht. Die Proteinmenge wurde über mVenus-Fluoreszenz basierend auf einem Standardplot bestimmt. Die geschätzte Gesamtmenge des TMC-1-Komplexes einschließlich TMC-1, CALM-1 und TMIE beträgt 60 ng. Die isolierte native TMC-1-Probe wurde mittels SDS-PAGE analysiert und die Proteinbanden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Für die massenspektrometrische Analyse wurde der mutmaßliche Peak des dimeren TMC-1-Komplexes gepoolt und zur weiteren Verwendung auf ein Volumen von 50 µl konzentriert. Die gleiche Isolierungsmethode wurde verwendet, um die Wildtyp-Wurmprobe aus dem Stamm C. elegans N2 zur Verwendung als Kontrolle in den Massenspektrometrieexperimenten herzustellen, um die unspezifische Bindung von C. elegans-Proteinen an die Anti-Flag-M2-Affinität zu bewerten Harz.

Der native TMC-1-Komplex, gebunden an Anti-Flag M2-Affinitätsharz, wurde mit einem Puffer eluiert, der 20 mM Tris-Cl (pH 8,5), 150 mM NaCl und 0,02 % (Gew./Vol.) GDN, ergänzt mit 1 mg ml, enthielt −1 2×Flag-Peptid bei 4 °C für 40 min auf einem Rotator. Das Eluat wurde konzentriert und einer weiteren Reinigung über eine SEC-Säule unterzogen. Der mutmaßliche Peak des dimeren TMC-1-Komplexes wurde gepoolt und für SiMPull verwendet.

Deckgläser und Objektträger wurden gereinigt, passiviert und mit einer Lösung bestehend aus 50 mM Methoxypolyethylenglykol (mPEG) und 1,25 mM biotinyliertem PEG in Wasser beschichtet. Eine Strömungskammer wurde durch Bohren von 0,75-mm-Löchern in einen Quarzschlitten und durch Anbringen von doppelseitigem Klebeband zwischen den Löchern geschaffen. Auf den Objektträger wurde ein Deckglas gelegt und die Kanten mit Epoxidharz versiegelt, wodurch kleine Flusskammern entstanden. Anschließend wurde eine Lösung aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,25 mg ml-1 Streptavidin enthielt, auf den Objektträger aufgetragen, 5 Minuten lang inkubiert und mit einem Puffer bestehend aus 50 mM Tris, 50 mM NaCl und 0,25 mg ml abgewaschen −1 Rinderserumalbumin (BSA), pH 8,0 (T50 BSA-Puffer). Biotinylierter Anti-GFP-Nanokörper in T50 BSA in einer Menge von 10 µg ml−1 wurde auf den Objektträger aufgetragen, 10 Minuten lang inkubiert und mit 30 µl Puffer A (20 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,02 % ( w/v) GDN, 3 mM CaCl2).

Der TMC-1-Komplex wurde wie unter „Isolierung des nativen TMC-1-Komplexes für SiMPull“ beschrieben isoliert. Der Komplex wurde durch SEC gereinigt, 1:200 verdünnt und sofort in die Kammer gegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation wurde der Objektträger mit 30 μl Puffer A gewaschen und die Kammer mit einem Leica DMi8 TIRF-Mikroskop mit einem 100-fach-Ölimmersionsobjektiv abgebildet. Die Bilder wurden mit einer von hinten beleuchteten EMCCD-Kamera (Andor iXon Ultra 888) mit einem Bildbereich von 133 × 133 µm und einer Pixelgröße von 13 µm aufgenommen. Diese Pixelgröße von 13 µm entspricht aufgrund des 100x-Objektivs 130 nm auf der Probe. Um die unspezifische Bindung an den Objektträger abzuschätzen, wurde der gereinigte TMC-1-Komplex in eine separate Kammer gegeben, in der der Anti-GFP-Nanokörper nicht enthalten war und die anderen Schritte identisch blieben. Die in dieser Kammer beobachtete Punktzahl wurde verwendet, um die Anzahl der Hintergrundfluoreszenzpunkte abzuschätzen.

Photobleichfilme wurden durch 60-sekündige Belichtung des Bildbereichs aufgenommen. Um die Anzahl der TMC-1-Untereinheiten zu zählen, wurden Einzelmolekül-Fluoreszenzzeitspuren des mit mVenus markierten TMC-1-Komplexes mithilfe eines benutzerdefinierten Python-Skripts generiert. Jede Spur wurde manuell so bewertet, dass sie ein bis drei Bleichschritte aufwies, oder wurde verworfen, wenn keine sauberen Bleichschritte identifiziert werden konnten. Die resultierende Verteilung der Bleichschritte entspricht weitgehend einer Binomialverteilung für ein dimeres Protein, basierend auf einer geschätzten GFP-Reifung von 80 %. Insgesamt wurden 600 Moleküle aus drei separaten Filmen bewertet. Die Bewertung wurde durch Beurteilung der Intensität des Flecks überprüft; Im Durchschnitt waren die Moleküle, die in zwei Schritten bleichen, doppelt so hell wie diejenigen, die in einem Schritt bleichen.

Die gereinigte TMC-1-Komplexprobe wurde getrocknet, in 5 % Natriumdodecylsulfat, 8 M Harnstoff, 100 mM Glycin (pH 7,55) gelöst, mit (Tris(2-carboxyethyl)phosphin bei 37 °C für 15 Minuten reduziert, mit alkyliert Methylmethanthiosulfonat für 15 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von der Zugabe von angesäuertem 90 % Methanol und 100 mM Triethylammoniumbicarbonatpuffer (TEAB; pH 7,55). Die Probe wurde dann in einer S-Trap-Mikrosäule kurz mit 2 µg Tryp/LysC verdaut Proteasemischung, gefolgt von einem Waschen und 2-stündigem Verdau bei 47 °C mit Trypsin. Die Peptide wurden mit 50 mM TEAB und 50 % Acetonitril, 0,2 % Ameisensäure eluiert, gepoolt und getrocknet. Jede Probe wurde in 20 µl 5 %iger Lösung gelöst. Ameisensäure und injiziert in Thermo Fisher QExactive HF-Massenspektrometer. Proteinverdaus wurden mittels Flüssigkeitschromatographie mit einem Dionex RSLC UHPLC-System getrennt und dann an ein QExactive HF (Thermo Fisher) unter Verwendung von Elektrospray-Ionisation mit einer Nano Flex Ion Spray Source (Thermo Fisher) abgegeben. Ausgestattet mit einer 20-um-Emitter-Sprühspitze aus Edelstahl mit Nanobohrung und einer Quellenspannung von 1,0 kV. Zur Steuerung des Systems kam Xcalibur Version 4.0 zum Einsatz. Die Proben wurden mit 10 µl min−1 10 Minuten lang auf eine Symmetry C18-Trap-Kartusche (Waters) aufgetragen und dann auf eine 75 µm x 250 mm große NanoAcquity BEH 130 C18-Säule mit 1,7 µm großen Partikeln (Waters) unter Verwendung von Wasser als mobile Phase (A) umgeschaltet. und Acetonitril (B) mit 0,1 % Ameisensäure, 7,5–30 % Acetonitril-Gradient über 60 min und 300 nl min−1 Durchflussrate. Vermessungsmassenspektren wurden über m/z 375–1400 mit einer Auflösung von 120.000 (m/z 200) erfasst und die datenabhängige Erfassung wählte die zehn am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen für die Tandem-Massenspektrometrie durch Kollisionsdissoziation mit höherer Energie unter Verwendung einer Isolationsbreite von 1,2 m aus /z, normalisierte Kollisionsenergie von 30 und eine Auflösung von 30.000. Der dynamische Ausschluss wurde auf „Auto“ eingestellt, der Ladezustand für MS/MS +2 bis +7, die maximale Ionenzeit 100 ms, das minimale AGC-Ziel 3 × 106 im MS1-Modus und 5 × 103 im MS2-Modus. Die Datenanalyse wurde mit Comet (v. 2016.01, rev. 3)51 anhand einer Version der kanonischen FASTA-Proteindatenbank vom Januar 2022 durchgeführt, die UniProt-Sequenzen von C. elegans und verkettete sequenzumgekehrte Einträge enthielt, um Fehlerschwellenwerte und 179 häufige Kontaminationssequenzen und deren Umkehrung abzuschätzen Formen. Comet sucht nach allen Proben, die mit Trypsin-Enzymspezifität durchgeführt wurden, wobei die Massentoleranz für monoisotopische Elternionen auf 1,25 Da und die Massentoleranz für monoisotopische Fragmentionen auf 1,0005 Da eingestellt ist. Eine statische Modifikation von +45,9877 Da wurde allen Cysteinresten und eine variable Modifikation von +15,9949 Da den Methioninresten hinzugefügt. Eine lineare Diskriminanztransformation wurde verwendet, um die Identifizierungsempfindlichkeit der Comet-Analyse zu verbessern52,53. Für alle Peptide mit sieben oder mehr Aminosäuren wurden separate Histogramme für Übereinstimmungen mit Vorwärtssequenzen und für Übereinstimmungen mit umgekehrten Sequenzen erstellt. Die Bewertungshistogramme umgekehrter Übereinstimmungen wurden verwendet, um die Rate falscher Peptidentdeckungen (FDR) abzuschätzen und Bewertungsschwellenwerte für jede Peptidklasse festzulegen. Der Gesamtprotein-FDR betrug 1,2 %.

Ein Volumen von 3,5 μl des konzentrierten TMC-1-Komplexes wurde auf ein Quantifoil-Gitter (R2/1 300 Gold Mesh, bedeckt mit einem 2 nm durchgehenden Kohlenstofffilm) aufgetragen, das in Gegenwart von Amylamin 30 s lang bei 15 mA glimmentladen wurde . Die Gitter wurden mit einem Vitrobot Mark IV für 2,5 s mit einer Blotkraft von 0 nach 30 s Wartezeit bei 100 % Luftfeuchtigkeit und 15 °C geblottet und schockgefroren. Die Gitter wurden in flüssigem Ethan tauchgefroren und mit flüssigem Stickstoff gekühlt.

Der native TMC-1-Komplexdatensatz wurde mit einem 300 keV FEI Titan Krios-Mikroskop gesammelt, das mit einem K3-Detektor ausgestattet war. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden im Superauflösungsmodus (0,4195 Å pro Pixel) mit einer 105.000-fachen Vergrößerung aufgenommen, was einer physikalischen Pixelgröße von 0,839 Å pro Pixel entspricht. Die Bilder wurden mit einer 3×3-Mehrloch-pro-Stufen-Verschiebung und einer 6-Mehrfach-Schuss-pro-Loch-Methode unter Verwendung von Serial EM mit einem Defokusbereich von –1,0 bis –2,4 µm aufgenommen. Jeder Filmstapel wurde 3,3 s lang belichtet und bestand aus 50 Bildern pro Film mit einer Gesamtdosis von 50 e− Å−2. Insgesamt wurden 26.055 Filme gesammelt.

Die strahlinduzierte Bewegung wurde durch Patch-Bewegungskorrektur mit einem Ausgabe-Fourier-Crop-Faktor von 1/2 (0,839 Å pro Pixel) korrigiert. Die Parameter der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) wurden durch Patch-CTF-Schätzung in CryoSparc v3.3.154 geschätzt. Insgesamt wurden 25.852 Filme durch manuelle Kuration ausgewählt und die Partikel wurden mithilfe eines Blob-Pickers mit minimalen und maximalen Partikeldurchmessern von 140 Å bzw. 200 Å ausgewählt. Zunächst wurden 7,9 Millionen Partikel mit einer Boxgröße von 400 Pixeln ausgewählt und extrahiert und 4x (3,356 Å pro Pixel) gruppiert. Nach einer Runde der 2D-Klassifizierung wurden „Schrott“-Partikel entfernt, was insgesamt 3,2 Millionen Partikel ergab. Die Partikel mit den Merkmalen mit der höchsten Auflösung, etwa 1,5 Millionen, wurden für die Ab-initio-Rekonstruktion verwendet. Der vollständige Partikelstapel bestehend aus 3,2 Millionen Partikeln aus der 2D-Klassifizierung wurde dann einer heterogenen Verfeinerung unter Verwendung der rekonstruierten Modelle aus der Ab-initio-Rekonstruktion unterzogen. In diesem Schritt wurden wahrscheinliche monomere TMC-1-Komplexe, Detergensmizellen und zusätzliche Abfallpartikel entfernt, was 1,65 Millionen Partikel ergab. Anschließend wurden die Partikel aus nicht gruppierten Bildern erneut extrahiert. Anschließend wurde eine heterogene Verfeinerung unter Verwendung der C1-Symmetrie mit den erneut extrahierten 1,65 Millionen Partikeln durchgeführt, was 8 Klassen ergab. Darunter wurden drei gute Klassen bestehend aus 667.000 Partikeln ausgewählt und für die weitere Analyse verwendet. Nach einer Runde heterogener Verfeinerung mit 4 Klassen in C2-Symmetrie wurden zwei Klassen mit 208.000 und 199.000 Partikeln unterschieden, jede mit unterschiedlichen Merkmalen, die wir als kontrahierte bzw. erweiterte Form beschreiben. Für beide Partikelstapel wurde eine weitere Runde heterogener Verfeinerung durchgeführt, um Gruppen homogener Partikel aus jeder Klasse auszusortieren. Um eine höhere Auflösung und eine verbesserte Kartenqualität zu erreichen, wurde in Cryosparc v3.3.1 für jede einzelne Klasse eine ungleichmäßige Verfeinerung einschließlich Defokussierung und globale CTF-Verfeinerung mit Partikelstapelgrößen von 141.000 (verkleinert) und 142.000 (erweitert) durchgeführt, was zu Auflösungen von führte 3,09 Å bzw. 3,10 Å.

Unter den ersten 8 Klassen aus der heterogenen Verfeinerung von 1,65 Millionen Partikeln hatte eine der Klassen, die 272.000 Partikel enthielt, ein zusätzliches Dichtemerkmal in der Nähe von CALM-1. Mit dieser Klasse wurde eine weitere heterogene Verfeinerung und 3D-Klassifizierung ohne Ausrichtung durchgeführt, um heterogene Partikel auszusortieren. Eine weitere Runde heterogener Verfeinerung in Cryosparc führte zu einer vielversprechenden Partikelklasse mit 99.000 Partikeln von insgesamt vier Klassen. Mit der ausgewählten Klasse wurde eine ungleichmäßige Verfeinerung, einschließlich Defokussierung und globale CTF-Verfeinerung, durchgeführt, was zu einer Karte mit einer Auflösung von 3,54 Å führte. Um die Dichte des an CALM-1 gebundenen unbekannten Proteins zu verbessern, wurde eine lokale Verfeinerung in Cryosparc unter Verwendung einer Maske durchgeführt, die die „zusätzliche Dichte“ und CALM-1 abdeckte.

Die ursprüngliche elektronenmikroskopische Dichtekarte wurde mit Phenix AutoSharpen55 geschärft, und zur Strukturbestimmung wurden sowohl geschärfte als auch ungeschärfte Karten verwendet. Für den Modellaufbau wurden verschiedene Strategien verwendet, darunter De-novo-Konstruktion, Strukturvorhersage, Docking und homologe Modellierung. Die von Alphafold256 als Vorlage vorhergesagten Transmembranhelices von TMC-1 (TM1–TM9, ohne TM10) wurden mit Starrkörperanpassung in UCSF Chimera57 und De-novo-Modellbildung mit Coot58 in die Karte eingepasst. Die mögliche Ionenpermeationspore des Kanals wurde mit MOLE 2,059 bestimmt. Kohlenhydratgruppen wurden an einer vorhergesagten N-verknüpften Glykosylierungsstelle auf hervorstehende N209-Dichten auf TMC-1 modelliert.

Um die Struktur von CALM-1 in die erweiterte Konformationsdichtekarte des TMC-1-Komplexes einzubauen, nutzten wir die zuvor bestimmte Struktur von CIB3 im Komplex mit einem TMC-1-Peptid (Proteindatenbank-ID: 6WUD). Wir haben CIB3 mithilfe der Starrkörperanpassung in UCSF Chimera in die Dichtekarte angedockt, wobei wir die hochkonservierten H5- und H6-Helices von TMC-1 als Wegweiser verwendet haben, und fuhren fort, indem wir die Sequenz von CALM-1 in das Modell einführten, gefolgt von einer manuellen Anpassung von das Modell mit Coot. Konservierte sperrige Seitenketten, darunter F84, Y129 und F197, die in hydrophobe Hohlräume hineinragen und den Helices von TMC-1 zugewandt sind, erleichterten die Definition des korrekten Registers der CALM-1-Sequenz.

Die Hilfsuntereinheit TMIE wurde mithilfe von Coot manuell in die Dichtekarte der erweiterten Konformation eingebaut. Die Dichte der sperrigen Seitenkette von Tryptophan (W25) und die Lipidmodifikation am Cysteinrest (C44) halfen bei der Zuordnung des Sequenzregisters im Kontext der Dichtekarte. Das Modell wurde gegenüber der geschärften Karte durch Realraumverfeinerung in Phenix verfeinert.

Die folgenden Regionen von TMC-1 wurden aufgrund schwacher oder fehlender Dichten nicht in die Karte modelliert: Die N-terminale Region von TMC-1 (M1 bis P73), die vorhergesagte Schleifenregion zwischen TM5 und TM6 (S460 bis N663) und die C-terminale Region (L886 bis D1285). Die Seitenketten mit schwacher Dichte auf den Helices H1 (75–87) und TM10 (870–885) wurden als Alaninreste modelliert. Die N-terminale Region von CALM-1 von den Resten 1 bis 17 und die Aminosäuren von TMIE, einschließlich 1–17 und 64–117, wurden aufgrund mangelnder Dichte nicht modelliert. Wie im Haupttext diskutiert, schlagen wir vor, dass die Reste 1–17 von TMIE ein Signalpeptid umfassen.

Für die Modellierung der unbekannten Dichte auf CALM-1 haben wir basierend auf den Ergebnissen der Massenspektrometrie spekuliert, dass ARRD-6 ein möglicher Kandidat für ein Hilfsprotein sei. Obwohl die Gesamtkartenqualität der mutmaßlichen ARRD-6-Region für die De-novo-Modellerstellung nicht ausreichte, konnten wir auf der Karte mehrere β-Faltblätter mit Seitenkettendichten finden. Mithilfe der vorhergesagten Struktur von ARRD-6 und der gekreuzten Vorsprünge zweier Schleifen der N- und C-Domänen von Arrestin (82–85 der N- und 249–256 der C-Domäne) konnten wir die vorhergesagte ARRD ausrichten -6-Modell in die unbekannte Dichte und liefert damit einen weiteren Beweis dafür, dass es sich bei der unbekannten Dichte um ARRD-6 handelt. Die geschätzte lokale Auflösung der ARRD-6-Dichte liegt zwischen 4 und 7 Å und der berechnete Q-Score des ARRD-6-Modells zur Karte aus dem MapQ60-Plugin in Chimera beträgt 0,25, was der geschätzten Auflösung von 4,91 Å entspricht, was darauf hindeutet Das Modell ist sinnvoll in der Karte platziert. Der endgültige CC des ARRD-6 und des Gesamtmodells beträgt 0,42 bzw. 0,69. Alle Zahlen für Dichtekarten und -modelle wurden von Pymol und ChimeraX generiert.

Molekulardynamiksimulationen wurden sowohl für die C- als auch für die E-Konformation und mit zwei verschiedenen Auflösungen durchgeführt: grobkörnig (CG) und All-Atom (AA). Ausgehend von der durch Kryo-EM modellierten Struktur wurden eine C-terminale Carboxyl-Kappengruppe, eine N-terminale Ammonium-Kappengruppe, fehlende Seitenketten und alle Wasserstoffatome mithilfe des PSFGEN-Plugins von VMD61 modelliert. PROPKA wurde verwendet, um den pKa von titrierbaren Resten abzuschätzen62,63. Alle titrierbaren Seitenketten wurden in ihrem Standardprotonierungszustand gefunden. Die modellierten Strukturen wurden dann zum Aufbau der CG- und AA-Simulationen verwendet.

Die Martini-basierten CG-Modelle64,65,66 der TMC-1-Komplexe wurden unter Verwendung des Martinize-Protokolls erstellt, wie auf der Martini-Website (http://www.cgmartini.nl/) beschrieben, gefolgt von der Anwendung eines elastischen Netzwerks auf das Atom Paare innerhalb eines 10 Å-Grenzwerts. Die CG-Parameter für das palmitoylierte Cys in TMIE wurden aus einer früheren Arbeit erhalten67. Die anfängliche Orientierung des Proteins in der Membran wurde aus der Datenbank der Orientierungen von Proteinen in Membranen (OPM) übernommen. Die Proteinkomplexe wurden dann in eine Lipiddoppelschicht aus Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidyl-Ethanolamin (PE), Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidyl-Cholin (PC), Sphingomyelin (SM) und Cholesterin mit einem Molverhältnis von 54:32 eingefügt: 8:6. Das in den CG-Simulationen verwendete Sphingomyelin war das DPSM-Lipid im Martini-Jargon, entsprechend C(d18:1/18:0) N-Stearoyl-d-erythro-Schwänzen. In den AA-Simulationen war Sphingomyelin PSM im CHARMM-Kraftfeld, entsprechend N-Palmitoylsphingomyelin (PSM). Die Sekundärstrukturen der Proteine ​​wurden aus den AA-Modellen abgeleitet und während der CG-Simulationen beibehalten. Um die Probenahme zu verbessern und die Statistik zu verbessern, wurden mit dem Computerprogramm Insane68 vier Kopien des Proteins in jeder Konformation in einem großen Patch (400 × 400 Å2) der Lipiddoppelschicht in einem Abstand zwischen den Proteinen von 200 Å eingebettet. Anschließend wurden die Systeme solvatisiert und mit 150 mM NaCl unter Verwendung von Insane ionisiert (Systemgröße: 330.000 CG-Kügelchen).

Die CG-äquilibrierten Protein-Membran-Komplexe nach 8 μs CG-Simulationen wurden unter Verwendung von CHARMM-GUI69,70 auf CHARMM-basierte AA-Modelle zurückgebildet, gefolgt von der Isolierung eines der vier Replikate (eine Proteinkopie mit einer Membranpolsterung von etwa 40). Å) vom größeren Membranfleck. DOWSER wurde verwendet, um das Protein intern zu hydratisieren71,72. Die Protein-Membran-Systeme wurden dann mit Wasser einschließlich 150 mM NaCl in VMD (Systemgröße: 340.000 Atome) solvatisiert. Um die Statistiken zu verbessern und jegliche Verzerrung durch die anfängliche Lipidplatzierung weiter zu reduzieren, wurden für jede Konformation drei unabhängige Membransysteme mit unabhängig platzierten anfänglichen Lipiden mithilfe des Membranmixer-Plugins (MMP)73 generiert.

CG-Systeme wurden mit GROMACS74 simuliert, mit den Standardsimulationsparametern von Martini v2.266. Die Simulationen wurden mit einem Zeitschritt von 20 fs durchgeführt. Die Temperatur wurde unter Verwendung eines Geschwindigkeits-Neuskalierungsthermostaten75 mit einer Zeitkonstante von 1 ps für die Kopplung auf 310 K fixiert. Ein halbisotroper Druck von 1 bar wurde durch den Berendsen-Barostat76 mit einer Kompressibilität von 3 × 10−4 bar und einer Relaxationszeitkonstante von 5 ps aufrechterhalten. Die Energie der Systeme wurde zunächst für 1.000 Schritte minimiert, gefolgt von Relaxationsläufen von 18 ns, während die Lipiddoppelschicht-Kopfgruppen und Proteinrückgrate harmonisch zurückgehalten wurden. Während der ersten 18 ns wurden die auf die Doppelschicht-Kopfgruppen angewendeten Beschränkungen schrittweise entfernt (von k = 200 kJ mol−1 nm−2 bis Null), während die Beschränkungen auf dem Proteinrückgrat (k = 1.000 kJ mol−1 nm−2) blieben unverändert. Die 4-Proteinsysteme in jeder Konformation wurden dann 10 μs lang simuliert, wobei Einschränkungen nur auf die Proteinrückgrate angewendet wurden, was zu einer kumulativen Probenahme von 80 μs führte (4 Kopien × 2 Konformationen × 10 μs).

Die AA-umgewandelten Systeme wurden mit dem folgenden Protokoll simuliert: (1) 5.000 Schritte der Minimierung, gefolgt von 5 ns Entspannung, während der die schweren Atome der Proteine ​​sowie die gebundenen Ca2+-Ionen harmonisch zurückgehalten wurden (k = 10 kcal mol−). 1 Å−2) zu ihrer Position im Kryo-EM-Modell; (2) 1 ns Gleichgewicht mit harmonischen Beschränkungen nur an den schweren Atomen des Proteinrückgrats (k = 10 kcal mol−1 Å−2). Die Koordination der Ca2+-Ionen in diesem Schritt wurde durch die Anwendung des Extra Bonds-Algorithmus in NAMD aufrechterhalten77,78, (3) 200 ps Äquilibrierung, während der die Beschränkungen am Grundgerüst aufrechterhalten wurden, während die Extra Bonds an den Ca2+-Ionen entfernt wurden; (4) Zwei zusätzliche Replikate wurden mit dem MMP-Plugin generiert und 1 μs Produktionsläufe wurden mit jedem der drei unabhängigen Simulationsreplikate durchgeführt, während nur die schweren Atome des Proteinrückgrats zurückgehalten wurden. Die Schritte 1–3 wurden mit NAMD277,78 durchgeführt. Die 1-μs-Produktionsläufe für alle drei Replikate wurden auf Anton279 durchgeführt.

Alle AA-Simulationen wurden unter Verwendung der vollständig atomistischen Kraftfelder CHARMM36m80 und CHARMM3681 für die Proteine ​​bzw. Lipide durchgeführt. Wassermoleküle wurden mit TIP3P82 modelliert. In NAMD-Simulationen wurde ein Grenzwert von 12 Å für nicht gebundene Wechselwirkungen mit kurzer Reichweite verwendet, wobei der Schaltabstand bei 10 Å begann. Das Partikelnetz Ewald (PME) wurde zur Berechnung weitreichender elektrostatischer Wechselwirkungen83 mit einer Gitterdichte von 1 Å−1 und einer PME-Interpolationsordnung von 6 verwendet. Der SHAKE-Algorithmus wurde verwendet, um Bindungen an Wasserstoffatomen einzuschränken84. Die Temperatur wurde mit einem Langevin-Thermostat mit einem Dämpfungskoeffizienten von 1,0 ps−1 konstant bei 310 K gehalten. Der Druck wurde mit dem Nosé-Hoover-Langevin-Kolbenbarostat mit einer Periode und einem Abfall von 100 bzw. 50 fs auf 1 atm gehalten85,86. Alle Systeme wurden in einer flexiblen Zelle simuliert, die es ermöglichte, die Abmessungen der periodischen Zelle unabhängig voneinander zu ändern und gleichzeitig das Seitenverhältnis in der xy-Ebene (Membranebene) konstant zu halten. Der Zeitschritt wurde auf 2 fs eingestellt und die PME- und Lennard-Jones-Kräfte wurden bei jedem zweiten bzw. jedem Zeitschritt aktualisiert.

Für Anton2-Simulationen wurden eine Temperatur von 310 K und ein Druck von 1 bar durch die Nosé-Hoover-Kettenkopplung und Martyna-Tuckerman-Klein-Schemata85 gehalten, die mithilfe eines Multigratorschemas87 implementiert wurden. M-SHAKE wurde verwendet, um alle Bindungen an Wasserstoffatome zu beschränken88, und in allen Simulationen wurde ein Zeitschritt von 2,5 fs verwendet. Die weitreichenden elektrostatischen Wechselwirkungen wurden mithilfe der Methode der schnellen Fourier-Transformation (FFT) an Anton279 berechnet.

Die Wirkung des Proteins auf die Dicke jedes Membransegels wurde sowohl in CG- als auch in AA-Simulationen quantifiziert, indem der z-Abstand (Membrannormal) der Phosphatgruppen von Phospholipiden in Bezug auf die Mittelebene der Doppelschicht über die zweite Hälfte jeder Flugbahn überwacht wurde ( letzten 5 μs der CG-Simulationen oder den letzten 500 ns der AA-Simulationen). Die Dickenwerte wurden unter Verwendung eines Histogramms mit 2 × 2 Å2-Bins in der xy-Ebene (Membranebene) für jedes Blättchen einzeln aufgezeichnet. Cholesterin- und Phospholipidverteilungen wurden auf ähnliche Weise berechnet, indem die Positionen der Hydroxy- (für Cholesterin) oder Phosphatkügelchen (für Phospholipide) über die letzten 5 μs der CG-Trajektorien in Histogrammen summiert wurden.

Zunächst wurden die individuellen Lipidzahlen für alle Lipidspezies innerhalb von 7 Å (unter Verwendung von Cholesterinhydroxyl- oder Phospholipidphosphatkügelchen) der vier Proteinkopien über die 10 μs der CG-Simulation bestimmt. Anschließend wurde ein Depletion-Anrichment-Index für den Lipidtyp L mithilfe der folgenden Gleichung89 definiert:

Dabei ist Verhältnis(L)7A die Anzahl der Moleküle des Lipidtyps L innerhalb von 7 Å von Proteinkopien als Bruchteil der Gesamtzahl von Lipidmolekülen innerhalb von 7 Å von Proteinkopien und Verhältnis(L)bulk ist die Anzahl von Molekülen von Lipidtyp L in der Membran als Bruchteil der Gesamtzahl der Lipidmoleküle in der Membran.

Die Kryo-EM-Struktur der E-Konformation des TMC-1-Komplexes von C. elegans (enthaltend sechs Ketten: zwei TMC-1, zwei CALM-1 und zwei TMIE) wurde als Vorlage für die Erstellung eines Homologiemodells von menschlichem TMC-1 verwendet Komplex. Jede Kette in der Template-Struktur wurde isoliert und ihre Sequenz mit AlignMe90 an die entsprechende menschliche Sequenz angeglichen. Die ausgerichteten Sequenzen wurden dann in der Mehrkettenfähigkeit von MODELLER91 verwendet, um einen menschlichen TMC-1-Komplex zu erzeugen. Zur Beurteilung der Qualität des generierten Modells wurden die Methoden Discrete Optimized Protein Energy (DOPE)92 und GA34193,94 verwendet. Die Optimierung wurde mit einer maximalen Iteration von 300 durchgeführt und das Modell mit der besten molekularen Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion (molpdf) wurde ausgewählt (Extended Data Abb. 7). Der gesamte Optimierungszyklus wurde zweimal wiederholt, um eine bessere Struktur zu erhalten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Koordinaten und Volumina für die Kryo-EM-Daten wurden in der Electron Microscopy Data Bank unter den Zugangscodes EMD-26741 (erweiterte Konformation), EMD-26742 (kontrahierte Konformation) und EMD-26743 (mit ARRD-6) hinterlegt. Die Koordinaten wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 7USW (erweiterte Konformation), 7USX (kontrahierte Konformation) und 7USY (mit ARRD-6) hinterlegt. Alle anfänglichen und endgültigen Schnappschüsse der molekulardynamischen Trajektorien sowie Simulationsparameter und Konfigurationsdateien sind unter https://doi.org/10.5281/zenodo.6780283 hinterlegt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken T. Nicolson, P. Barr-Gillespie, D. Farrens, M. Mayer, A. Aballay, J. Ge, J. Elferich und Mitgliedern der Laboratorien Gouaux und Baconguis für hilfreiche Diskussionen; S. Petrie und B. Jenkins für ihre Hilfe bei der Spektralbildgebung von Würmern; T. Provitola für Hilfe bei Zahlen; A. Reddy für massenspektrometrische Analyse; J. Meyers und S. Yang für ihre Hilfe beim Kryo-EM-Screening und der Datenerfassung; A. Chinn für Hilfe beim Wurmwachstum; und R. Hallford für das Korrekturlesen. Erste Kryo-EM-Gitter wurden am Pacific Northwest Cryo-EM Center (PNCC) überprüft, das durch den NIH-Zuschuss U24GM129547 unterstützt wird, und am PNCC an der OHSU durchgeführt, auf den über EMSL (grid.436923.9), eine Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, zugegriffen werden kann gesponsert vom Büro für biologische und Umweltforschung. Der große Einzelpartikel-Kryo-EM-Datensatz wurde auf dem Janelia Research Campus des Howard Hughes Medical Institute (HHMI) gesammelt. Die OHSU Proteomics Shared Resource wird teilweise durch die NIH-Hauptzuschüsse P30EY010572 und P30CA069533 unterstützt. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse 1F32DC017894 an SC unterstützt. Die Simulationen wurden durch die NIH-Zuschüsse P41-GM104601 und R01-GM123455 an ET unterstützt. Simulationen wurden unter Verwendung von Zuweisungen für Anton am Pittsburgh Supercomputing Center (Zuschuss MCB100017P an ET) und bereitgestellten XSEDE-Ressourcen durchgeführt von den National Science Foundation Supercomputing Centers (XSEDE-Zuschussnummer MCA06N060 an ET). EG dankt J. LaCroute und B. LaCroute für ihre Unterstützung und ist Forscher des HHMI.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hanbin Jeong, Sarah Clark

Vollum Institute, Oregon Health and Science University, Portland, OR, USA

Hanbin Jeong, Sarah Clark, April Goehring und Eric Gouaux

Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health and Science University, Portland, OR, USA

April Goehring & Eric Gouaux

Theoretical and Computational Biophysics Group, NIH Center for Macromolecular Modeling and Bioinformatics, Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Sepehr Dehghani-Ghahnaviyeh, Ali Rasouli und Emad Tajkhorshid

Abteilung für Biochemie, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Sepehr Dehghani-Ghahnaviyeh, Ali Rasouli und Emad Tajkhorshid

Zentrum für Biophysik und quantitative Biologie, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Sepehr Dehghani-Ghahnaviyeh, Ali Rasouli und Emad Tajkhorshid

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HJ, SC und AG führten die Experimente durch. HJ, SC und AG haben zusammen mit EG das Projekt entworfen und das Manuskript geschrieben. SD-G., AR und ET führten Molekulardynamiksimulationen durch und analysierten sie. Alle Autoren haben zur Manuskripterstellung beigetragen.

Korrespondenz mit Eric Gouaux.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Eduardo Perozo und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a: Spektrales konfokales Bild der mVenus-Fluoreszenz bei einem erwachsenen tmc-1::mVenus-Wurm, das mVenus-Fluoreszenz in den Kopfneuronen, Zilien und Körperwandmuskeln zeigt. Dargestellt ist ein repräsentatives Bild von insgesamt fünf Bildern. b, Repräsentatives FSEC-Profil des TMC-1-Komplexes, erkannt über das mVenus-Tag. Der Einschub zeigt ein silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel des gereinigten TMC-1-Komplexes. Ein rotes Sternchen zeigt TMC-1 an. Die Experimente wurden zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Thyreoglobulin (669 kDa) und Apo-Ferritin (443 kDa) wurden als Protein-Molekularmassenstandards verwendet. c: Die Verteilung der mVenus-Photobleichungsschritte für den TMC-1-Komplex stimmt mit einer Binomialfunktion (graue Balken) und einer Anordnung mit zwei Fluorophoren überein. Insgesamt wurden n = 600 Spots aus drei Photobleichfilmen (200 Spots pro Film) an zufälligen Stellen in der Bildgebungskammer analysiert. Jeder Film wird durch einen blauen Punkt dargestellt. d: Es werden Bilder für den SEC-gereinigten mVenus-markierten TMC-1-Komplex gezeigt, der mit einem biotinylierten Anti-GFP-Nanokörper eingefangen wurde. Maßstabsbalken = 5 µm. e, Repräsentative Spur, die die zweistufige Photobleichung (rote Pfeile) des mVenus-markierten TMC-1-Komplexes zeigt.

a, Proteine, die durch MS über ihre zugehörigen Peptidfragmente erkannt werden, werden mit ihrem Gennamen und ihrer Molekularmasse aufgelistet. Die Anzahl der identifizierten einzigartigen Peptide sowohl aus dem nativen TMC-1-Komplex als auch aus Wildtyp-Würmern (C. elegans N2), die als Kontrolle verwendet wurden, ist ebenfalls angegeben. b: Aminosäuresequenz und Sekundärstruktur von C. elegans TMC-1 werden gezeigt. Die auf der Kryo-EM-Struktur basierende Sekundärstruktur ist über den Sequenzen als Zylinder (α-Helices), schwarze Linien (Schleifenregionen) oder gestrichelte Linien (ungeordnete Reste) angegeben. Rote Linien über den Sequenzen zeigen C. elegans-Peptide an, die durch MS gefunden wurden. . Beachten Sie, dass die TMC-1-Segmente der Sequenz 13–33, 557–566, 567–587, 877–890, 897–904, 917–927, 972–996, 1041–1052, 1177–1190, 1192 entsprechen –1216 und 1261–1269 werden ebenfalls von MS gefunden, aber in b nicht angegeben.

Flussdiagramm für die Kryo-EM-Datenanalyse der E- und C-Konformation des TMC-1-Komplexes.

Flussdiagramm für die Kryo-EM-Datenanalyse des TMC-1-Komplexes mit ARRD-6.

a: Eine repräsentative Kryo-EM-Aufnahme des TMC-1-Komplexes zusammen mit mehreren 2D-Klassen jeder wichtigen 3D-Klasse. Jeder andersfarbige Kreis (grün, rot und blau) auf dem Mikrobild zeigt Partikel an, die den jeweiligen Konformationen zugeordnet wurden – erweitert, kontrahiert bzw. mit ARRD-6. Maßstabsbalken = 200 Å. b, Winkelverteilungen der endgültigen Rekonstruktionen. c, Elektronendichtekarte jedes Modells, gefärbt durch lokale Auflösungswerte. d, Fourier-Shell-Korrelationskurve (FSC) für jedes Modell. e, Fragmente der Kryo-EM-Dichtekarte und des Atommodells von TMC-1 und jeder Hilfsuntereinheit. Die Kryo-EM-Karten werden als violettes Netz angezeigt.

a, b, c. Strukturen von TMEM16A (5OYB), OSCA1.2 (6MGV) und dem TMC-1-Komplex aus den gleichen relativen Perspektiven betrachtet. Die Seitenansichten der Transmembranregionen und die Draufsichten sind im Cartoon-Modell dargestellt. Mutmaßliche Ionen werden als rote Kugeln dargestellt.

a: Die Orte von Cysteinmutationen, die die TMC-1-Einzelkanalleitfähigkeit in Mäusen stören, sind auf dem TMC-1-Komplex von C. elegans dargestellt. Die C. elegans-Restnummer ist beschriftet und der entsprechende Maus-Rest ist in Klammern angegeben. b, Die Struktur des TMC-1-Komplexes und die Orte von Mutationen, die mit Hörverlust oder Taubheit verbunden sind. Die Cα-Positionen der betreffenden Reste werden als gelbe (TMC-1), violette (CALM-1) oder blaue (TMIE) Kugeln angezeigt. c, Eine Tabelle der in Tafel b gezeigten Rückstände. Mutationen, die beim Menschen zu Hörverlust und Taubheit führen, sind schwarz bzw. blau gefärbt.

a, Homologiemodell des menschlichen TMC-1-Komplexes: TMC-1 (dunkelblau und hellblau), CIB2 (orange und gelb) und TMIE (rot und rosa). b, Eine erweiterte Ansicht des mutmaßlichen Ionenleitungswegs, wobei porenauskleidende Rückstände hervorgehoben werden. Polare (gelb), saure (rot) und basische (blau) Rückstände werden als Stäbchen dargestellt. c, Das elektrostatische Potenzial porenauskleidender Rückstände wird in verschiedenen Farben dargestellt: grau = unpolar, gelb = polar, rot = sauer, blau = basisch. Saure, basische und polare Reste sind gekennzeichnet.

a: Ein TMC-1-Protomer in der E-Konformation (blau) und der C-Konformation (grün), überlagert basierend auf Alpha-Kohlenstoffatomen im Rückgrat, wobei Konformationsänderungen in TMC-1 sowie CALM-1 und TMIE hervorgehoben werden. Die Drehachse wird als roter Balken dargestellt und Pfeile geben die Drehrichtung vom C- in den E-Zustand an. b: Membrandicke in der C-Konformation, berechnet aus den letzten 500 ns der atomistischen MD-Trajektorien, gemittelt über alle drei Simulationsrepliken. Heatmaps, die der Dicke extrazellulärer und zytoplasmatischer Blättchen entsprechen, werden im linken bzw. rechten Feld angezeigt.

a, Vier TMC-1-Komplexe (grau) in der E-Konformation, eingebettet in eine Lipiddoppelschicht aus PC, PE, SM und Cholesterin (CHOL), dargestellt in Cyan, Gelb, Orange bzw. Grün, mit einem Molverhältnis von 32:54:8:6. b, Anreicherungs-Abreicherungs-Indizes jeder Lipidkomponente in der Nähe des Proteins, erhalten aus den Simulationen der E- (durchgezogene Balken) und C- (gestreifte Balken) Konformationen. Die PC- und PE-Dichten in der Masse und in der Nähe des Proteins sind ähnlich, wohingegen SM im Verhältnis zu ihren Massenkonzentrationen in der Nähe des Proteins abgereichert und CHOL angereichert ist. Datenpunkte werden als rote Punkte angezeigt. Mittelwert- und Fehlerbalken werden aus 1000 Datenpunkten in jedem Balkendiagramm berechnet und Fehlerbalken sind Standardabweichungen der Daten. c, Heatmaps, die Verteilungen verschiedener Lipidspezies um das Protein in der E-Konformation darstellen. Jede Verteilung wird aus den letzten 5 μs der Trajektorie berechnet und über alle vier Proteinkopien gemittelt. d und e: Für die extrazellulären und zytoplasmatischen Blättchen berechnete Dickenmuster, gemittelt über die letzten 5 𝜇s der CG-Trajektorien der E- bzw. C-Konformationen. Der Querschnitt des Proteins ist rot dargestellt. Die Farbskala stellt die Dicke jedes Blättchens dar, wobei Blau und Gelb für eine Ausdünnung bzw. Verdickung stehen. E- und C-Konformationen erzeugen unterschiedliche Membrandeformationsmuster.

Diese Datei enthält ergänzende Abbildungen. 1–3.

Rohdaten für original silbergefärbte und Coomassie-gefärbte Gele. a, Originales silbergefärbtes Gel (siehe Erweiterte Daten Abb. 1b (Einschub)). b, Original Coomassie-gefärbtes Gel (siehe ergänzende Abbildung 2a). Gelbe Kästchen zeigen an, wie die Gele zugeschnitten wurden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jeong, H., Clark, S., Goehring, A. et al. Strukturen des TMC-1-Komplexes beleuchten die mechanosensorische Transduktion. Natur 610, 796–803 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05314-8

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Eingegangen: 04. Mai 2022

Angenommen: 02. August 2022

Veröffentlicht: 12. Oktober 2022

Ausgabedatum: 27. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05314-8

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